自杀未遂与5-羟色胺转运体基因的连锁不平衡研究＊

高新学,艾 明,陈建梅,黎雪梅,甘 窈,况 利△

(1.山东省济宁市精神病防治院精神六科 272051;2.重庆医科大学附属第一医院心理卫生中心 400016)

自杀未遂与5-羟色胺转运体基因的连锁不平衡研究＊

高新学1,艾 明2,陈建梅2,黎雪梅2,甘 窈2,况 利2△

(1.山东省济宁市精神病防治院精神六科 272051;2.重庆医科大学附属第一医院心理卫生中心 400016)

目的 探讨自杀未遂与5-羟色胺转运体(5-HTT)基因之间的分子遗传学关系。方法 以重庆地区汉族人群中自杀未遂核心家系作为研究对象,采集86个核心家系的258个家系成员的肘静脉血,将其分为患者组与父母组。应用聚合酶链反应(PCR)和限制性片段长度多态性方法,研究5-HTT基因启动子区多态性(5-HTTLPR)、5-HTT基因第二内含子多态性(5-HTTVNTR)与自杀未遂之间的分子遗传学关系,并进行基于单体型的单体型相对风险(HHRR)分析及连锁不平衡(TDT)分析。结果 父母组和患者组的5-HTTLPR、5-HTTVNTR基因型及等位基因频率的总体分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)。HHRR分析结果显示患者组与虚拟对照组的5-HTTLPR、5-HTTVNTR基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。多等位基因 TDT统计分析显示86个核心家系分别有54及89个杂合子父母纳入5-HTTLPR、5-HTTVNTR的统计,5-HTTLPR、5-HTTVNTR与自杀未遂间不存在连锁不平衡(P>0.05)。在5-HTT基因的2个多态性位点组合成的4种单体型中进行单体型分析,组间差异均无统计学意义(P>0.05),提示自杀未遂患者与这2个位点形成的单体型不存在传递上的偏倚。结论 5-HTT基因不是自杀未遂的主要遗传基因。

自杀未遂;等位基因;基因频率;多态现象,遗传;色胺类

据WHO统计,全球自杀率在14.5/100 000左右。最近的研究显示中国每年约有25万人死于自杀,还有约200万人自杀未遂[1]。自杀在国内已成为一个极其严重的公共卫生问题。自杀的生化研究结果显示自杀未遂者和自杀死亡者体内的5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)功能均下降,且这种变化与自杀者是否患某种精神疾病无关[2]。因此,自杀候选基因主要从与5-HT的合成、失活、作用及转运等相关的酶或受体基因中选择,如色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH)基因、5-HT转运体(5-HT transporter,5-HTT)基因及单胺氧化酶基因等。近年来5-HTT已成为自杀未遂病因研究的一个新方向。

目前国外对5-HTT的遗传学研究主要集中在启动子和第二内含子的基因多态性方面,而国内罕有相关报道。有研究显示5-HTT基因与自杀行为之间无明显关联,自杀性家族史是自杀行为的明显特征,这种家族的攻击性较高,是构成自杀倾向的一部分,并在家族中被不断地继承下来[3]。比较有、无自杀行为的精神障碍患者,发现自杀未遂者的亲属中有自杀行为的比较普遍,推测自杀行为的风险与遗传因素有关[4]。由于不同种族的基因可能存在差异,因此,本研究进行了汉族人群自杀未遂与5-HTT基因启动子区多态性(serotonin-transporter-linked polymorphic region,5-HTTLPR)、5-HTT 基因第二内含子多态性(serotonin transporter gene 2 VNTR poly-morphism,5-HTTVNTR)的相关性研究以及核心家系的传递不平衡分析,探讨5-HTT基因与自杀未遂行为的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象为2007年1月至2008年3月在重庆医科大学附属第一医院心理卫生中心住院部及急诊科就诊的自杀未遂者及其生物学父母,共收集86个汉族核心家系258人,将其分为患者组及父母组:患者组86例,其中男38例,女48例;年龄16～45岁,平均(32.6±11.8)岁;父母组172例。纳入标准:(1)年龄不低于15岁;(2)有自杀未遂行为;(3)患者之间均无血缘关系;(4)自愿参加本研究,并签署书面知情同意书。自杀未遂定义为主动结束自己的生命未造成死亡的结局,包括决心自杀但未死亡和自杀意图不强而蓄意自伤[5]。采用美国国立精神卫生研究所分子遗传学研究家庭问卷(family interview for genetic studies,FIGS)自编家系调查表(包括社会人口学资料、疾病发作特点、家族史、个人史及既往治疗情况等)并结合测量工具[如北京回龙观医院北京心理危机研究及干预中心设计的自杀态度及心理健康调查量表、肖水源自杀意念调查表及DSM-IV-TR轴I障碍临床定式检查(structured clinical interview for DSM-IV-TR axis I disorders-patient,SCID-I/P)][6]进行检查,由2名经过严格操作培训的高年资精神科医师评定。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的制备 采集研究对象肘静脉血5 mL,用0.2%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝,常规酚-氯仿法抽提基因组DNA。

1.2.2 引物 5-HTTLPR和5-HTTVNTR引物均参考文献[7]。上游引物分别为:5′-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3′;5′-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3′,下游引物分别为 :5′-GAG GAC TGA GCT GGA CAA CC AC-3′;5′-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGTG-3′。引物由上海生物工程技术有限公司合成。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增试剂盒亦由上海生物工程技术有限公司提供。

1.2.3 PCR反应 PCR反应液共50μL,含有50～100 ng基因组DNA、10 pmoL 引物、1U TaTaRa Ex Taq酶、10×Ex Taq缓冲液(不含 Mg2+)、2.5 mmol/L dNTPs、1.5 mmol/L MgCl2,用双蒸水补充至50μL。5-HTTLPR多态性位点PCR反应条件为95℃预变性4min,94℃变性30 s,56℃退火30 s;72℃延伸 1min,35个循环;最后72℃延伸 10min。5-HTTVNTRPCR反应条件为94℃预变性4min,94℃变性1min,61℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环;最后72℃延伸10min。将 PCR产物于2%琼脂糖凝胶中电泳分离,以溴乙锭染色法检测各区带,与相对分子质量标准物比较各片段的大小。

1.3 5-HTT基因多态性位点的 HHRR分析 采用 HHRR关联法对86个家系进行分析,将患者父母的4个等位基因划分为两组,传递给患病子女的的2个等位基因为患者组,即患者基因型;未传给子女的2个等位基因为对照组,即虚拟对照组,然后计算患者组和虚拟对照组的基因频率,进行差异显著性检验,并计算相对风险。

1.4 统计学处理 遗传学资料采用Spielman等[8]的传递不平衡检验(transmission disequilibrium test,TDT),运用 Genehunter2.1软件进行分析,一般资料采用 SPSS13.0统计软件进行分析,基于单体型的单体型相对危险度(haplotype-based haplotype relative risk,HHRR)分析采用χ2检验,对基因型频率和基因频率采用 Hardy-Weinberg平衡检验。以 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5-HTTLPR与5-HTTVNTR的Hardy-Weinberg平衡的吻合度检验 将86个核心家系中的父母组和患者组的基因分型后,其基因型观察值和期望值的 Hardy-Weinberg平衡吻合度良好:5-HTTLPR位点父母组χ2=2.496,P=0.114;患者组χ2=1.275,P=0.259。5-HTTVNTR位点父母组χ2=1.626,P=0.202;患者组χ2=2.415,P=0.120。患者组及父母组均符合该平衡定律,提示选择的个体间无血缘关系。

2.2 5-HTTLPR与5-HTTVNTR基因型和等位基因频率分布

2.2.1 5-HTTLPR基因型和等位基因频率分布 由表1可见,5-HTTLPR父母组和患者组基因型和等位基因频率的总体分布差异均无统计学意义(χ2=0.088,P=0.767;χ2=2.670,P=0.263)。

表1 5-HTTLPR患者组及父母组基因型及等位基因频率分布[n(%)]

2.2.2 5-HTTVNTR基因型和等位基因频率分布 由表2可见,父母组和患者组5-HTTVNTR基因型和等位基因频率的总体分布差异均无统计学意义(χ2=0.939,P=0.330;χ2=4.892,P=0.087)。

表2 5-HTTVNTR患者组及父母组基因型及等位基因频率分布[n(%)]

2.3 5-HTTLPR与5-HTTLPR位点的 HHRR分析

2.3.1 5-HTTLPR位点 HHRR分析 根据表3患者组5-HTTLPR位点等位基因的传递情况,按χ2=2N(W×Z-X×Y)2/(W+X)(W+Y)(X+Z)(Y+Z)计算,患者组与虚拟对照组之间的5-HTTLPR位点基因频率差异无统计学意义(χ2=0.260,P>0.05)。

表3 5-HTTLPR位点的 HHRR分析

2.3.2 5-HTTVNTR位点的 HHRR分析 根据表4患者组5-HTTVNTR位点等位基因的传递情况,按χ2=2N(W×Z-X×Y)2/(W+X)(W+Y)(X+Z)(Y+Z)计算,患者组与虚拟对照组之间的5-HTTVNTR位点基因频率差异无统计学意义(χ2=2.770,P>0.05)。

表4 5-HTTVNTR多态性位点的 HHRR分析

2.4 5-HTT L PR与5-HTTLPR位点的 TDT分析 根据父母基因型在患病子女中的传递情况,在86个家系中进行 TDT分析[9-10]。

2.4.1 5-HTTLPR位点的 TDT分析 5-HTTLPR位点的多基因 TDT统计结果见表5。在收集的86个家系中共有54个杂合子父母纳入分析,他们分别传递了33个S等位基因和21个L等位基因给患病子女。按χ2=(b-c)2/(b+c)计算和Monte Carlo逼真法1 000次重复校正后的经验 P值,显示5-HTTLPR位点与自杀未遂之间不存在连锁不平衡(χ2=2.670,P>0.05)

表5 5-HTTLPR位点的 TDT分析

2.4.2 5-HTTVNTR位点的 TDT分析 5-HTTVNTR位点的多基因 TDT统计结果见表6。在收集的86个家系中共有89个杂合子父母纳入分析,他们分别传递了38个10等位基因和51个12等位基因给患病子女。按χ2=(b-c)2/(b+c)计算和经Monte Carlo逼真法1 000次重复校正后的经验P值,显示5-HTTVNTR位点与自杀未遂之间不存在连锁不平衡(χ2=1.900,P>0.05)。

表6 5-HTTVNTR位点的 TDT分析

2.5 5-HTT基因各位点组合的单体型分析 5-HTT基因的两个多态性位点共组合成4种单体型,见表7。父母单体型S12中有31个传递给了患者,22个未传递(χ2=1.530,P>0.05)。S10中有 24个传递,37个未传递(χ2=2.770,P>0.05)。L12中有 13个传递,17个未传递(χ2=0.530,P>0.05)。L10中有 2个传递,4个未传递(χ2=0.670,P>0.05)。提示自杀未遂患者与这2个位点形成的4种单体型均不存在传递上的偏倚。

表7 5-HTT基因各位点组合的单体型分析

3 讨 论

近年来许多学者探讨了5-HTT基因与自杀行为的关系,5-HTT可能是自杀行为的一个生物学基础[11],Anguelova等[12]提出5-HTT在自杀中可能起着自杀易患病体质的角色。1994年 Ramamoorthy等[13]克隆了5-HTT基因,人类5-HTT基因定位于17q11.1～q12(基因标志是SLC6A4)与D17S98紧密相邻,跨度37.8 kb,由14个外显子组成,编码蛋白大约由630个氨基酸组成,目前共发现5-HTT有3种多态性。国外对5-HTT的遗传学研究主要集中在5-HTTLPR和5-HTTVNTR的基因多态性方面,国内有学者对5-HT2A受体基因多态性与自杀行为,以及5-HT2A受体基因A-1438G多态性与精神疾病患者自杀未遂的关系进行了研究[14-15],而5-HTT基因与自杀未遂的关系仍无相关报道。

5-HTTLPR为人类和灵长类所特有,在人类情绪调节方面有非常重要的作用。它影响5-HTT的转录活性与功能。长片段“L”转录活性比短片段“S”高2.5倍,而且具有 S/L或S/S基因型者与具有L/L基因型者比较,前者的淋巴细胞5-HTT基因的转录较少,蛋白表达较弱。同时5-HT代谢途径中释放到突触间隙的5-HT的回吸收率比L/L基因型者低,5-HTTLPR可能通过影响基因的转录活性和5-HTT蛋白的功能而影响5-HT的回吸收速率,使5-HT系统功能不同,“S”等位基因能减少5-HTT基因的转录和5-HTT蛋白的表达,从而使5-HT的回吸收率减少。

5-HTTVNTR存在17 bp的可变数目串联重复多态性,关于5-HTTVNTR的功能,目前还不十分清楚。有研究显示5-HTTVNTR可能在调节5-HTT蛋白表达方面发挥一定的作用,该序列长度大小可能影响5-HTT基因的转录活性[16]。

3.1 5-HTTLPR和5-HTTVNTR的基因型和基因频率的分析 不同人群,基因型分布不同。本研究通过 PCR技术显示来自重庆地区的汉族人群中,在5-HTTLPR位点仅仅扩增出2个等位基因“L”和“S”,组成LL、LS及 SS 3种基因型。528 bp片段为“L”,484 bp片段为“S”,并未发现文献报道的L+(528 bp)等位基因[17],这可能与取样不同有关。本研究结果显示,L/L基因型占7.0%,L/S基因型占30.2%,S/S基因型占62.8%,L等位基因频率为22.1%,S等位基因型频率为77.9%,与高树贵等[18]和艾明等[19]报道基本一致。可见此位点的多态性可能存在明显的种族和地域差异。

本研究中在5-HTTVNTR位点也仅扩增出2个等位基因:10 repeat(简称10)与12 repeat(简称12)等位基因,组成3种基因型10/10、10/12、12/12,267 bp片段为10 repeat,301 bp为12 repeat。未发现所报道的9 repeat等位基因[20]。作者认为9 repeat是人群中的稀有片段,在取样较少的情况下可能观察不到。本研究结果显示,10/10基因型占15.1%,10/12基因型占37.2%,12/12基因型占47.7%,10等位基因频率为33.7%,12等位基因频率为66.3%。与国内艾明等[21]报道基本一致。而与国内文献高树贵等[22]报道的有明显差异,与欧洲和北美人种差异显著。

本研究结果显示患者组和父母组的5-HTTLPR与5-HTTVNTR位点的基因型和基因频率均无明显差异,与国内报道一致[18-21]。说明5-HTT基因多态性可能与人种及地域的差别有关。

3.2 5-HTTLPR和5-HTTVNTR与自杀未遂患者的连锁不平衡分析 本研究采用核心家系作为研究对象,避免了因遗传背景不同而对研究结果的影响。所有家系都来自重庆地区,人口流动性相对较小,具有较好的遗传同质性。HHRR检验结果显示患者组与虚拟对照组之间的5-HTTLPR位点和5-HTTVNTR位点基因频率均缺乏关联性。TDT检验也提示5-HTTLPR位点和5-HTTVNTR位点与自杀未遂患者均不存在连锁不平衡。

在既往对重庆地区自杀未遂与正常对照的研究中也未发现5-HTTLPR和5-HTTVNTR基因型及等位基因频率与自杀未遂有关联[19-21]。Hranilovic等[20]对克罗地亚的自杀死亡与正常对照的研究发现5-HTTVNTR基因型、等位基因频率与自杀死亡缺乏关联,De Luca等[23]对自杀未遂的对照研究中未发现二者存在关联,Russ等[24]也未发现自杀与5-HTT基因相关。目前的研究均显示5-HTTVNTR基因型、等位基因频率与自杀行为缺乏关联。

本研究还发现5-HTTLPR和5-HTTVNT组成的4个单体型均不存在连锁不平衡。由于时间的限制,只研究了2个位点的多态性,组成的4个单体型未发现其与自杀未遂的关联。但这并不能排除在多个位点组合的单倍体中会存在某些关联。本研究采用以家系为基础的对照研究方法,较好地解决了患者组与父母组的配对问题,排除了遗传背景的不一致性,避免出现假阳性结果及群体结构分层的现象。

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Research of linkage disequilibrium bet ween suicide attempts and 5-hydroxytryptamine transporter gene＊

Gao Xinxue1,Ai Ming2,Cheng J ianmei2,Li Xuemei2,Gan Yao2,Kuang Li2△
(1.Sixth Department ofPsychiatry,J ining Psychiatric Hospital,J ining,S hangdong272051,China;2.Mental Health Center,First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China)

Objective To discuss the molecular genetics correlation between suicide attempts and 5-hydroxytryptamine transporter(5-HTT)gene.Methods Nuclear family with suicide attempts of Han nationality in Chongqing area was served as research object.Cubital venous blood were collected from 258 members in 86 nuclear families,and they were divided into patient group and parents goup.Polymerase chain reaction(PCR)and restriction fragment length polymorphism method were employed to study the molecular genetics correlation between serotonin-transporter-linked polymorphic region(5-HTTLPR)or serotonin transporter gene 2 VNTR polymorphism(5-HTTVNTR)and suicide attempts,and haplotype-based haplotype relative risk(HHRR)and transmission disequilibrium test(TDT)analysis were conducted.Results Differences of overall distribution of 5-HTTLPR,5-HTTVNTR polymorphism genotype and allele frequencies between parents goup and patient group showed no statistically significant(P>0.05).HHRR analysis demonstrated that there was no statistically significant difference in allele frequencies of 5-HTTLPRand 5-HTTVNTRbetween patient group and the virtual control group(P>0.05).Multi-allele TDT statistical analysis showed that there were 54 and 89 heterozygous parents from 86 nuclear families were recruited to conduct 5-HTTLPRand 5-HTTVNTRanalysis,respectively.Both 5-HTTLPRand 5-HTTVNTRshowed no linkage disequilibrium with suicide attempts(P>0.05).Analyzing 4 haplotypes composed of 2 polymorphic sites of 5-HTTgene showed no statistically significant difference among them(P>0.05),suggesting that biased transmission did not exist in patients with suicide attempts and haplotypes composed of these 2 polymorphic sites.Conclusion 5-HTTgene is not a major gene involving suicide attempts.

suicide,attempte;alleles;gene frequency;polymorphism,genetic;tryptamines

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.17.010

A

1671-8348(2011)17-1689-04

重庆市卫生局科研项目(07-2-049)。△

,Tel:13908379733;E-mail:Kuangli0308@l63.com。

2011-03-30

2011-04-17)