基因工程神经干细胞治疗缺氧缺血性脑损伤研究进展

王 军，朱登纳

郑州大学第三附属医院小儿脑瘫康复中心郑州450052

缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因。目前临床上常用的治疗新生儿HIBD的方法如高压氧疗法、亚低温疗法等都仅局限于对症、支持治疗，只能在一定程度上缓解症状，尚难从根本上恢复神经系统功能。大量研究［1-3］发现，通过移植具有多向分化潜能的神经干细胞(neural stem cells，NSCs)能减少HIBD新生大鼠由于局部缺血而导致的神经细胞死亡，使之运动和学习记忆能力均得到提高。将经过基因修饰的NSCs进行移植，有望为HIBD的治疗提供一个崭新的思路。

1 HIBD的研究进展

HIBD是指各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤，是儿童时期最主要的致残性疾病，往往导致永久性的神经心理缺陷，如脑性瘫痪、精神发育迟滞、学习困难及癫痫等。目前研究认为大脑室管膜下区是NSCs聚集区域，该区细胞对缺氧缺血特别敏感，围产期缺氧缺血时，该区细胞相继坏死、凋亡，导致大脑及小脑皮层、基底神经节和脑室周围白质区软化，NSCs再生困难，神经元增殖、分化及髓鞘化障碍，进而导致婴幼儿脑白质病变，而脑白质损伤会进一步造成各种慢性神经功能障碍，重者造成脑的永久性损伤。因此在发生HIBD时减少大脑室管膜下区干细胞的丢失或补充干细胞是关键。

HIBD的治疗方法主要有:药物治疗，手术治疗，高压氧，亚低温和运动康复治疗及NSCs移植等。

药物治疗包括脑代谢激活剂、血管扩张剂及各类神经营养因子等的应用。目前，很多药物虽然在动物模型上证明具有神经保护作用，但却没有被广泛认同的确切的临床疗效［4］。

选择性脊神经后根切断术、肌腱松解术等手术治疗主要应用于HIBD引起的痉挛型脑瘫患儿，但创口损伤大、并发损害多，只能短期缓解痉挛症状，远期疗效尚待进一步证实。

有研究［5］已证实高压氧可减轻急性期脑损伤的程度，促进损伤脑组织的修复，但存在最佳时间窗，随时间窗延长效果会大大降低。另外，对于早产儿和极低出生体质量儿有发生新生儿视网膜病变引起失明及支气管肺发育不良的风险，需慎重选择。

运动康复是指通过患者自身的力量或治疗师的辅助操作或借助于器械进行主动或被动运动训练，以改善局部或全身功能为目的的一种治疗方法［6］。但这种方法只能在一定程度上缓解症状，很难达到完全康复。

亚低温治疗是目前惟一被认为对HIBD早期有保护作用的治疗措施［7］，轻至中度的低温可以减轻缺血引起的脑水肿，对实验性HIBD大鼠脑确有保护作用，但该疗法只能在HIBD后6 h内实施，而且要维持一定的时间(一般24～48 h)才有效，但在临床上很难把握最佳的治疗时机，低体温同时也可能会增加梗死面积，使病情恶化，且目前尚未取得令人信服的研究结果。

目前，对于HIBD的治疗尚无任何特效的方法［8］。而NSCs移植能在一定程度上弥补内源性NSCs的不足，替代因缺血缺氧而变性、坏死的神经细胞，使神经系统的正常结构和功能得到一定程度的修复［1，9］。这为中枢神经系统功能重建提供了新的思路，目前的研究也已取得令人鼓舞的结果。作者利用人脐血单个核细胞体外分离培养和定向诱导分化获得了表达神经细胞特异性标志物巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和纤维酸性蛋白的 NSCs［10］，解决了传统移植所用胎脑组织供体不足及免疫排斥的难题。作者的研究［11］还证实移植后的NSCs可在HIBD新生大鼠大脑室管膜下区存活、增殖及分化，促进组织结构恢复和细胞功能重建。新近研究［12］报道有学者进行重度HIBD后遗症患儿的人NSCs移植，术后患儿神经运动功能在短时间内明显改善，肌力明显提高，肌张力明显降低，运动功能明显恢复，对声光电反应灵敏，智力得到较快提高，短期疗效肯定。但是单纯的NSCs移植在移植后早期难以对宿主局部的病理改变产生积极影响，并且分化成神经元的比例较低，这可能是由于中枢神经系统损伤后炎症反应、胶质瘢痕等的存在，以及神经营养因子或诱导因子不足等使局部微环境不适合细胞再生，从而无法彻底恢复神经系统的结构及功能。单纯补充NSCs的数量以及单独应用神经营养因子在治疗脑损伤时均难取得令人满意的效果［13］。因此选用具有诱导NSCs定向分化为神经元和具有神经营养因子作用的基因作为目的基因，通过移植基因修饰的NSCs可较大程度地促进神经功能的恢复。

2 基因工程NSCs治疗HIBD的研究进展

基因工程NSCs治疗就是通过基因修饰使NSCs表达外源性基因，即在体外将编码神经营养因子、促生长因子、抗凋亡因子等的基因片段导入NSCs中，然后将其移植到受损部位，使其在移植局部有效表达，分泌大量治疗性神经营养因子，激活内源性NSCs，促进其迁移、增殖和分化，以防止神经元死亡并促进神经再生与功能恢复的一种治疗方法。Anton等［14］最早将基因工程NSCs应用于帕金森症大鼠的治疗，通过移植转染酪氨酸羟化酶基因的NSCs，使半数以上动物症状得到缓解。Gu等［15］使用NT-3基因修饰NSCs移植治疗帕金森大鼠模型也得到了相似结果。

基因工程NSCs在HIBD的治疗研究中也取得了很大的进展。An等［16］将缺氧诱导的VEGF和骨髓间充质干细胞联合移植治疗HIBD时发现，联合治疗组表达更多的 VEGF，抑制了细胞的凋亡。Chen等［17］将胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)基因修饰的NSCs(NSCs/GDNF)移植入脑缺血大鼠模型，大鼠神经损伤症状得到了有效控制，与单纯NSCs移植组相比，病灶区域 NSCs数量明显增加，而Caspase-3阳性细胞和TUNEL阳性细胞数量则大大减少，表明GDNF的表达有利于减少宿主神经细胞的凋亡。作者的研究团队［18-19］将胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor 1，IGF-1)基因转入NSCs内得以成功表达，并且发现 NSCs-IGF-1移植后，细胞可在HIBD大鼠脑内存活、增殖与分化，免疫组化法及神经行为学检测均证实了NSCs-IGF-1移植组治疗效果优于单独NSCs移植。

下面分别从5个方面对基因工程NSCs治疗HIBD进行概述。

2.1 NSCs作为载体细胞的优势 成纤维细胞和雪旺细胞经常作为基因治疗的载体细胞，用于周围神经损伤性疾病的移植治疗，但对诸如HIBD等中枢神经系统损伤性疾病的基因治疗，它们有明显的缺点:它们是非神经系统来源细胞，移植入脑后不能与宿主神经系统整合并形成突触连接，因而不能长期存活及稳定表达外源性基因。NSCs作为载体细胞则有其无可比拟的优势:首先NSCs可在体外大量扩增，转染后仍具有自我更新及多向分化的潜能，移植后可以在脑内迁移至损伤区并存活、增殖和分化，是理想的移植供体细胞;其次，易于外源基因的转染和表达，同时自身也能分泌多种神经营养因子。因此NSCs是HIBD基因治疗首选的载体细胞，通过移植基因修饰的NSCs，可同时达到细胞替代和基因治疗的双重功效。

2.2 目的基因的选择 基因工程NSCs治疗HIBD的目的不仅要实现细胞替代，还期望通过外源基因的表达改善移植局部微环境，促进内外源性NSCs的增殖和分化，而且主要向神经元方向分化等，因此目的基因的选择直接影响移植治疗效果。

神经营养因子是一类由神经元、神经胶质细胞产生的能对中枢和外周神经发挥营养作用的特殊蛋白质分子。神经营养因子参与构成局部微环境，促进中枢和周围神经系统神经元的存活及其突触生长，对NSCs和祖细胞的增殖、分化也起一定的作用，还可在神经修复中发挥作用，如支持受损中枢神经系统神经元的存活，刺激轴突的再生等。因此通常选用具有神经营养因子作用的基因作为目的基因。目前已发现的具有神经营养作用的因子有三十余种，其中研究较多的有神经生长因子、脑源性神经营养因子、GDNF、睫状神经营养因子、表皮生长因子、碱性纤维母细胞生长因子、IGF-1、神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4/5等。另外，作者研究团队的研究［20-21］还表明:Foxg1基因是 NSCs增殖分化关键调控因子，可促进NSCs向神经元方向分化;神经元素1参与了体外诱导人脐血干细胞向神经细胞分化的过程。这些基因都可选作HIBD治疗的目的基因。

2.3 转染方法 细胞转染是将目的基因导入靶细胞，是基因治疗的核心技术，成功的关键在于选择高效、低毒的转染方法，将目的基因特异地导入细胞中，使目的基因安全、忠实、长效地表达。基因转染的基本方法可分为3类:化学法、物理法和生物法。

化学法主要包括二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)转染法、磷酸钙共沉淀法、脂质体介导转染法。前两种方法均是使外源基因附着在靶细胞表面，然后靶细胞通过内吞作用将外源基因摄入。DEAE-葡聚糖法重复性好，DNA用量少，操作简单，但转染成功率较低;磷酸钙共沉淀法适用于对哺乳动物多种细胞的转染，但DNA用量大，且转染成功率较低。脂质体介导转染法是阳离子脂质体与带负电的DNA稳定结合形成包裹DNA的脂质双层复合物，复合物与靶细胞接触后通过融合的方式将目的基因传递到靶细胞。该法操作简单、转染成功率高，且脂质体免疫原性低，几乎无免疫排斥，因此该方法被认为是最具有广泛应用前景的细胞转染方法。

物理法主要指电穿孔法。电穿孔法是应用高压电击使细胞膜上出现许多小微孔，外源DNA通过小孔进入细胞。电穿孔法重复性好，转染成功率高，但高压脉冲会导致细胞大量死亡，比其他方法需要更多的靶细胞。对于其他方法不能成功转染的细胞，电穿孔法仍可使用。

生物法是指病毒载体介导的基因转染方法。常用的病毒载体包括逆转录病毒和腺病毒。逆转录病毒的优点是可感染分裂细胞，免疫原性较低，但其宿主细胞范围窄，感染效率低，载体容量小，最大不能超过10 kb。腺病毒具有容量大(最大可达36 kb)，可感染分裂和非分裂细胞等优点。逆转录病毒载体法可感染各时期细胞，表达稳定，因此是目前进行基因治疗研究最常用的转染方法之一。但是病毒载体免疫原性相对较高，会造成靶细胞损伤，从而影响目的基因的表达，同时安全性问题也是值得考虑的。

2.4 移植途径的选择 目前NSCs移植治疗HIBD的途径主要包括脑实质内移植、血液内移植和脑脊液内移植。

由于HIBD后7 d以内，损伤中心炎症反应剧烈，不利于移植细胞的生存，因此常选损伤边缘进行NSCs移植，而具体移植部位的选择直接影响移植效果。有研究［22］发现，将从人胚胎脑组织分离的NSCs移植入发育中的大鼠脑内，其分化细胞是部位特异性的:如移植入纹状体，NSCs在脑内能够广泛迁移;移植入海马，移植细胞则分布在海马及与白质相连的区域，在海马CA区分化为锥体细胞，在齿状回分化为神经元;移植入室管膜下区，细胞迁移至嗅球分化为颗粒细胞，这说明选择合适的移植部位对移植的NSCs功能的发挥非常重要。

脑实质内移植:定位准确，移植细胞可直接进入脑实质内，不受血液及其他体内环境的影响。但这种方法又会造成新的脑损伤，移植细胞数量不能太大，另外作为细胞载体的液体也有造成脑水肿的危险［23］。对于HIBD，由于损伤广泛分布在两侧脑半球，并不局限在某一特定位置，而脑内多点移植创伤过大，很难实施，因此移植效果难免会受到影响。

血液内移植:包括动脉内移植和静脉内移植。静脉内移植操作简单，对机体创伤小，传送细胞量大，并发症少，但移植效果受血液内成分及体内代谢等因素的影响较大。动脉内移植直接将移植细胞输送到脑部，减少了细胞在体内的损失，但对机体的创伤相对较大，操作相对复杂，所以应用远没有静脉内移植广泛。Pendharkar等［24］发现动脉内移植的效果明显优于静脉内移植，若要二者达到相同的效果，静脉内移植的细胞数量要远远高于动脉内移植。Willing等［25］则发现静脉内移植在长期效果上要明显优于脑实质内移植。同时血液内移植治疗HIBD不得不考虑血脑屏障的影响。移植的NSCs能否顺利通过血脑屏障直接影响移植的效果。实验还表明在HIBD时移植细胞可以顺利通过血脑屏障，这可能与下列因素有关:①缺氧直接导致毛细血管内皮细胞膜结构遭到破坏，膜流动性降低，通透性增高，同时细胞间紧密连接增宽开放。②缺氧缺血导致血液及组织中氧自由基增多，生物膜受到氧自由基作用可产生大量脂质过氧化物，导致膜流动性降低及膜的通透性增高。③缺氧引起血浆内皮素含量增高，从而导致内皮细胞损伤，血管内膜的屏障作用降低，通透性增加。

脑脊液内移植:常见的有腰穿蛛网膜下腔移植和脑室内移植。腰穿蛛网膜下腔移植相对于脑实质内移植来说，创伤小，操作简单，是干细胞移植治疗脊髓损伤时最常选择的方法。但对于HIBD，脑实质内移植更常用。选用脑室内移植主要是基于如下原因:①缺氧缺血时，外源性NSCs可在激活的内源性NSCs的引导下从脑室向损伤区域迁移［26］。②新生儿HIBD往往表现为脑实质多处损伤，而不局限于某一特定区域。脑内多部位移植损伤大，操作复杂，很难实现。而脑室内移植，只需一次性将NSCs进行移植，借助细胞迁移来完成对损伤区域的修复。③HIBD损伤局部呈现明显的炎症反应，毒性神经递质、氧自由基等不利于移植细胞的存活，而脑室内移植避免了局部不良微环境的影响，从而避免移植细胞被清除［27］。

2.5 移植时间的选择 HIBD后何时进行细胞移植才能达到最佳的治疗效果，目前尚无定论。理论上讲越早越好，但研究结果却否定了这个推测。对缺血损伤动物模型不同时间点移植效果的观察［28］发现:缺血后1周移植，NSCs存活率及神经元分化效率较缺血后立即移植要高，原因是HIBD急性期脑组织缺血、坏死，释放的兴奋性毒性神经递质、自由基和促炎症介质会严重威胁到移植物的存活，但后期脑内碱性纤维母细胞生长因子上调，可能更有利于移植物存活、增殖。有人［12］在缺血后3 d进行移植取得了良好的效果，原因可能是此时损伤引起的毒性化学物质释放开始减少，而细胞的分裂增殖在此时则达到高峰。另有研究［25］显示HIBD后1周内源性胶质瘢痕开始形成，阻碍神经突起发育，不利于细胞移植后脑结构及功能重建。不同的研究目的移植所选的时间不同。为了单纯研究供体细胞的神经重建功能，多把移植时间放在损伤1周以后，以排除神经营养因子的作用。对神经营养因子起主要作用的供体细胞如骨髓间充质干细胞，一般在损伤后3 d内移植，以最大限度发挥治疗作用。由此推测对于携带有神经营养因子基因的NSCs的移植也应在3 d以内。

3 问题及展望

目前，使用基因工程NSCs对HIBD的治疗研究已经取得了不小的进展，但在临床应用前还存在许多问题:①安全性问题。由于胚胎来源的NSCs的未分化状态及强大的分裂增殖能力以及同种异体使用，使得移植后有致瘤和发生异体排斥的危险，可以通过选择免疫原性低的脐血或反复传代至最佳状态降低其免疫原性或过度增殖能力来解决。②有效性及效果差异问题。由于物种及个体差异，治疗方法对动物有效，但对人能否发挥同样的作用还需进一步研究，尤其是多基因修饰的NSCs移植尚需大量的实验证实。③对移植后细胞的增殖、迁移、分化方向及功能发挥尚缺乏有效的调控措施。

未来的研究除了要解决以上问题之外，还需要对以下几个方面加以考虑:①进一步研究NSCs的生物学特性，优化体外培养条件，为临床应用提供充裕的细胞准备。②进一步研究移植后细胞在宿主体内存活、分化的调控机制。③由于神经系统重建及功能恢复所需时间较长，故移植远期效果尚需观察。④研究同时进行多基因、多部位移植的可能性，寻求更好的移植治疗方案。

尽管基因工程NSCs治疗HIBD尚存在诸多问题，但是这种治疗方法已经显示出其他方法无可比拟的优势，即可同时达到细胞替代和基因治疗的双重功效。相信今后分子生物学、细胞遗传学等各门学科的发展必将推动这种治疗方法的发展和完善。

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