革兰染色的现况和进展

叶元康

·生物诊断技术·

革兰染色的现况和进展

叶元康

本文对经典的革兰染色、革兰染色的自动染色仪、自动染色鉴别直读仪和革兰染色智能化与环保节水作一综述和展望。

革兰染色（Gram stain）是 1884 年由丹麦医师 Christain Gram 创立，染色将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类，在细菌学的形态鉴定、分类和用药选择等方面发挥了重要的作用[1]。世界各国常用的革兰染色为哈克改良法（Gram stain-Hucher modification），即经典的四步法革兰染色[2]，该染色使用 4 种试剂：结晶紫的混合液（crystal violet），碘液（iodine），酒精脱色液（alcohol decolorizer）和沙黄复染液（safranin O）。正规的染色时间约需 3 分钟 45 秒，试剂用量约 16 ml。但是哈克改良法的 crystal violet 在半年内就会出现沉淀，iodine 易自然升化，alcohol decolorizer 易挥发都是导致不良染色结果的重要原因。四步法革兰染色常受染液质量、实验者操作和细菌本身变化等因素影响，会将革兰阳性菌染成红色或革兰阴性菌染成紫色，误导或干扰实际工作，或产生不良后果。四步法革兰染色步骤多，操作麻烦，易出错，质量控制不易进行，难以做到标准化[3]。

近年来，革兰染色技术已有了不少改进：①快速染色，时间在 45 s 左右；②三步法革兰染色，1994 年美国 Difco公司的产品，将脱色与复染合二为一，可缩短染色时间、减少试剂用量、将脱色标准化和增加准确性；③ 1992 年美国CSM 公司的 Gram stain enhancer 能增强结晶紫的染色；④以stabilized iodine取代传统的碘液：稳定碘液为polyvinylpyrrolidone（PVP）iodine 可维持有效期达 15 个月之久；⑤ 以 Gram basic fuchsin 取代 Gram safranin 染厌氧菌、弯曲菌和李氏特菌更鲜红；⑥二步法革兰染色，2010年中国无锡 Faye 公司的产品，第一步为结晶紫初染，染色6 s，第二步为碘、酒精和品红混合液复染，染色 3 s，能得出与三步法和四步法一样的结果。二步法革兰染色液可稳定12 个月，节省生产原料 25％、降低生产成本30％、物流成本 50％ 和染色节水 50％。二步法染色工作效率比三步法和经典的四步法提高 3 ～ 4 倍[3-6]。

革兰染色的意义：①确定细菌的染色性，染成紫色的阳性菌或红色的阴性菌；②确定细菌的形态，有球菌、杆菌、弧菌等；③有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈阳性；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈阴性；④细菌性脑膜炎、肺炎、菌尿、淋病、脑、肺、腹部的感染和创伤时，革兰染色非常有用。例如疑似细菌性脑膜炎和关节炎患者的检样直接涂片染色发现病菌，可在获得培养结果前提供病原的参考；泌尿生殖道的检样，若发现革兰阴性双球菌，可作为诊断淋病的参考；女性阴道直接涂片，根据乳酸杆菌在镜下视野中的比例，有无滴虫或念珠菌的假菌丝和芽生孢子，可判断细菌性、念珠菌性或滴虫性阴道炎；⑤分离培养的菌落，细菌鉴定的第一步为革兰染色，根据染色性和形态，来确定下一步再做哪些试验；⑥在获得药敏结果前，革兰染色可作为医师选用抗生素的参考，革兰阳性菌对青霉素类抗生素敏感，革兰阴性菌对对氨基糖苷类抗生素敏感[7-8]。

鉴于革兰染色的重要性，革兰染色液和染色方法的质量控制尤为重要。临床微生物实验室都需要进行革兰染色液和染色方法的质量控制，通常用大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株进行，每批试剂每周至少 1 次质量控制，卫生部已制定了微生物实验室的全国临床检验操作规程。近年已有商品化的革兰染色用质量控制片，该产品是在玻片上涂有大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株未染部位，可监控染色液和染色方法的误差。商品化的革兰染色用质量控制片具有以下优点：①节省实验室进行革兰染色质控时制备培养基、培养质控菌株、保存质控菌株的时间和经费；②可对染色液、染色方法和细菌变异进行监控；③可做到质控菌培养的时间、涂片的菌量和制片的标准化。商品化的革兰染色用质量控制片是值得提倡的[9-10]。

目前国内外对微生物和细胞的染色、镜检和结果处理主要是靠人工操作。人工操作需要训练有素的人员；人工操作样本间误差大，缺乏可靠性和重现性，有人为和系统影响；人工操作难以质量控制、不易做到标准化；人工操作工作效率低；人工操作有染色废水污染环境；人工操作水资源消耗较大。鉴于人工操作的染色、镜检和结果处理的缺点，市场上已有自动革兰染色仪产品，如生物梅里埃公司（法国，2008年）、BD 公司（美国，2009 年）和赛德利公司（西班牙，2009 年），使得革兰染色实现了自动化。自动化染片能够节约时间，保证染片的准确性。无锡飞伊生物科技有限公司研制出新一代的自动染色鉴别直读仪（中国，2011年）克服了现有的自动染色仪不能显微照相和信息处理的不足。该仪器除能自动进行染色外，还能自动镜检、摄像和直接放大屏显染色结果，其 2TB 的硬盘存储器和网络联接功能，能调取、查询历史资料、建立患者档案、共享信息和做临床会诊。

革兰染色在细菌学的形态鉴定、分类和用药选择有重要的作用[11-12]。革兰染色随着科学技术的进步也会与时俱进。在自动化染色、自动化镜检和图像放大直读的基础上，今后的努力方向：①实现染色废水的净化处理和循环利用，做到环保节水；②建立临床样本和比对的标准数据库，做成能智能化比对的工作站；③研制出适用于革兰、抗酸、和血细胞染色的一机多用的新仪器。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.006

200065 上海，同济大学附属同济医院性病实验室，Email：yeying784@sohu.com

2011-11-14