国内外iPS细胞相关研究文献分析

汪楠，王冲，田玲

·调查与研究·

国内外iPS细胞相关研究文献分析

汪楠，王冲，田玲

胚胎干细胞因其分化的全能性被认为是攻克疑难杂症的“救星”，但因其技术尚未成熟，仍存在伦理方面的争论，寻找新的、能够规避伦理问题的多能干细胞源成为近年来干细胞研究的热门。2006 年，日本京都大学 Takahashi 和Yamanaka[1]在Cell上发表文章，首次报道了诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）的研究，掀开了 iPS 细胞研究的序幕。与 iPS 细胞相关的研究分别被《自然》和《科学》杂志评为 2007 年第一和第二大科学进展。短短几年间，iPS 细胞相关研究迅速升温，新成果不断涌现。本文拟通过检索国内外期刊文献数据库、专利文献数据库，对近年来国内外 iPS 细胞相关研究文献情况进行分析，为研究人员了解研究现状，把握相关研究热点提供参考。

1 期刊论文

1.1 国际期刊论文

国际期刊论文检索选择了美国国立医学图书馆下属国家生物信息中心开发的 PubMed 数据库。PubMed 数据库收录了 70 多个国家和地区的近 2 万种期刊，收录年代始于 1948 年，数据库更新及时，是公认的最具权威的生物医学文献检索系统。设定检索策略为“Induced pluripotent stem cells”或“iPS cells”（检索时间 2011 年 10 月 11 日），检出记录 1824 条，时间分布从 2006 年 8 月到 2011 年10 月。用 GoPubMed 分析工具进行分析。

首先提出 iPS 细胞概念的文章是 2006 年发表于Cell的“Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors”，Yamanaka教授领导的研究小组通过用逆转录病毒向小鼠皮肤的成纤维细胞中转入 4 个关键转录因子 Oct3/4、Sox-2、Klf-4、C-myc，使成纤维细胞发生再编程，所产生的细胞具有类似胚胎干细胞样的高度自我更新能力和分化潜能[1]。2007 年，又有日本和美国的多家研究机构成功诱导出了具有多向分化潜能的 iPS 细胞，美国和日本的刊物分别发表了相关研究论文 4 篇[2-5]和 5 篇[6-10]。经过 2006 年与 2007 年的探索阶段后，2008 年，德国、英国、中国等多个国家的研究陆续发表，论文数量显著增加。2010 年论文数量已接近700 篇，2011 年不到 10 个月的论文收录量已经超过了2010 年发表论文数的总和（图1）。

iPS 细胞相关文献的主题反映了近年研究的几大特点：① iPS 细胞的诱生方法研究仍是现阶段主要研究工作，涉及的主题包括基因、基因表达、转录因子等；②多数研究仍在实验室研究阶段，如有超过 600 篇文献研究涉及试验鼠；③疾病相关 iPS 细胞研究增多反映了临床应用的迫切需求，但试验研究中出现的种种问题又在一定程度上阻碍了iPS 细胞在临床的应用。

图1 iPS 细胞相关研究期刊论文年代分布情况（截至2011 年 10 月 11 日）

图2 iPS 细胞相关研究期刊论文国家分布情况（截至2011 年 10 月 11 日）

从国别来看：日本和美国 iPS 细胞相关研究方面实力最强，我国也已跻身世界前列；论文发表数量超过 50 篇的国家有 6 个，分别是美国、日本、中国、德国、英国和西班牙，这 6 个国家发表的相关文章数量超过总数的 70％，其中美国和日本的发文数量之和过半（图2）。从地区来看：美国生命科学的综合实力强，波士顿、洛杉矶等名校云集的地区 iPS 细胞相关论文的数量排在前两位；日本在 iPS 细胞研究方面不但开创了先河，还一直保持着领先的地位，京都、东京等地区是论文高产区，京都大学、东京大学等学府与科研机构实力强；我国的北京、上海、广州等地的大学与科研院所的发文量也较多，分别有 36 篇、29 篇、24 篇，其中发表在Nature和Cell-Stem Cell上关于诱生出 iPS小鼠的成果曾入选美国《时代周刊》评选的“2009年全球十大生物医学进展”[11-12]。

发表 iPS 细胞研究相关论文最多的杂志是Stem Cells杂志，排在第 2 ～ 5 位的期刊分别是Plos one、Cell-Stem Cell、Nature和PNAS（表 1）。

从作者的角度来看，美国和日本的研究者发表相关论文最多。包括 iPS 细胞鼻祖——日本京都大学的 Shinya Yamanaka 教授，之后是被国际干细胞学会评为“2009 年度杰出年轻科学家”的哈佛大学 Konrad Hochedlinger 教授、长期从事于干细胞核的替代重组和干细胞的表观遗传修饰工作的麻省理工学院 Rudolf Jaenisch 教授、曾任国际干细胞学会主席的哈佛医学院 George Daely 教授等。从作者间的合作关系来看，目前以国内研究者合作研究为主，跨区域的大型国际合作研究尚待开展（图3）。

我国 iPS 相关研究成果主要发表在国际期刊上，论文数量逐年上涨趋势明显（图4）。从发表文章的作者情况可以看出，作者之间的合作研究不多；发表文章最多的研究者数量不超过 2 篇，多数为 1 篇。

表1 国际期刊发表 iPS 细胞相关论文数量排名情况（截至 2011 年 10 月 11 日）

1.2 国内期刊论文

国内期刊论文检索选择了中国生物医学文献数据库（SinoMed）。SinoMed 数据库收录了 1978 年以来 1800余种中国生物医学期刊以及汇编、会议论文的文献题录 540余万篇，年增文献 40 余万篇，是国内医学科研工作者常用的国内文献数据库之一。设定检索策略为：中文标题或关键词为“iPS 细胞”或“诱导多能干细胞”（检索时间 2011 年10 月 28 日），检出记录 98 条，时间分布从 2008 年到2011 年，其中 2008 年 3 篇，2009 年和 2010 年分别为36 篇和 39 篇。

从论文数量上升可以反映出国内期刊对 iPS 细胞相关研究的关注度上升，但国内期刊发表的基础性研究成果并不多。通过手工筛选，2009 年 1 篇[13]、2010 年 6 篇[14-19]和 2011年 4 篇论文是基础性研究成果的发布[20-23]，其余均为综述性文章或研究进展报道。

2 专利文献

2.1 国内外专利

国内外专利文献检索选择 Derwent 专利数据库。Derwent Innovations Index（德温特国际专利数据库）是美国Thomson Scientific 公司开发的专利数据库，目前收录了自1963 年以来来自世界 42 个专利机构授权的 1460 多万项基本发明，3000 多万条专利，为研究人员提供世界范围内的化学、电子与电气以及工程技术领域内综合全面的发明信息，其权威性为广大科研人员所认可。由于 iPS 细胞没有专门的Derwent手工代码，检索策略主题设定为“Induced pluripotent stem cells”或“iPS cells”（检索时间 2011 年10 月 14 日），检出记录 254 篇。采用 TDA 软件进行分析。由于专利文献的收录有一定的滞后性，且由于 iPS 相关专利从 2008 年才开始出现，因此专利数量的分析在这里仅供参考。

图3 iPS 细胞相关研究者合作关系图（截至 2011 年 10 月 11 日）

尽管收录的专利数量不全，但从已收录的专利来看，相关专利数量在 2008 年（92 件）和 2009 年（165 件）增幅明显。从专利在专利权地区与国家的分布来看，美国以180 件位居榜首，日本、加拿大、韩国、欧洲、中国位居其后，专利数量在 10 ～ 30 件之间；从机构来看，除排在第一位的日本京都大学外，多为美国的大学与研究机构。根据现有专利的手工代码分类来看，主要集中的科学领域在D05-H08 细胞组织培养（cell or tissue culture）和 B14-S21细胞治疗（cell therapy）领域，这也正与近年来不断报道的多种 iPS 细胞诱生方法及 iPS 细胞疾病相关研究成果相吻合。

图4 我国学者在国际期刊上发表 iPS 细胞相关研究论文数量年代分布情况（截至 2011 年 10 月 11 日）

2.2 国内专利

通过检索国家知识产权局网站数据库检索在国内申请的 iPS 相关专利文献，设定检索策略为名称“iPS 细胞”或“诱导多能干细胞”（检索时间 2011 年 10 月 13 日），检索到 2008 年至 2011 年申请的专利 15 件，其中 2008 年 1 件，2009 年 8 件，2010 年 3 件，2011 年 3 件（由于专利收录的滞后性，数量仅供参考）。除日本东京大学（2 件）、美国细胞动力国际有限公司（1 件）、新加坡科技研究局（1 件）在我国申请的4件专利外，其余来自中国科学院广州生物医药与健康研究院（5 件）、中国科学院上海生命科学研究院（2 件）、中国人民解放军军事医学科学院（2 件）、上海交通大学（1 件）和浙江大学（1 件）。通观15 件专利，多为诱生 iPS 的相关方法，专利内容仍停留在基础研究阶段。

3 小结

由于 iPS 细胞技术使人们从胚胎干细胞的提取以及治疗性克隆等激烈的伦理学争论中解脱出来的可能性大大增加，这一研究领域的期刊论文数量迅猛增加、专利数量不断提升，显示了迅猛的增长势头。以美、日、中为首的相关科学研究团体不断取得基础与应用型试验研究的新突破，各种组织和器官细胞在试验中得以诱导和分化出来，在治疗心血管疾病[24]、镰刀形红细胞贫血[3]、脑神经疾病[25]等方面的研究也已取得不同程度的进展。从论文和专利发表的情况来看，我国在 iPS 细胞相关研究方面在国际上处于较为领先的地位，尤其是在基础研究方面取得一定成果，发表了一些在国际上较有影响力的文章。

在 iPS 细胞研究如火如荼之时，一些研究已使人们关注到该领域潜在的障碍。由于 iPS 细胞的诱导过程和肿瘤发生的过程相类似，早在 2008 年，刘实博士就对 iPS 细胞的致瘤性表示了担忧[26]，此后的研究中也发现了同样的问题；重编程错误及基因组不稳定性的缺陷可能导致 iPS细胞的临床治疗潜能受到限制[27-29]；应用型研究试验出现了iPS 细胞分化的组织自体移植产生免疫排斥反应的情况[30]。诸多问题的出现，使得研究者们开始重新审视对 iPS 细胞最初的乐观估计，并不断探寻新的方法。从论文发表与申请专利的主题来看，iPS 细胞相关专利仍然停留在诱导与制备层面，进入临床应用任重而道远。

[1] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126(4):663-676.

[2] Maherali N, Sridharan R, Xie W, et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell stem cell, 2007, 1(1):55-70.

[3] Hanna J, Wernig M, Markoulaki S, et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science, 2007, 318(5858):1920-1923.

[4] Meissner A, Wernig M, Jaenisch R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells. Nat Biotechnol, 2007, 25(10):1177-1181.

[5] Wernig M, Meissner A, Foreman R, et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature, 2007, 448(7151):318-324.

[6] Yamanaka S. Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2007, 1(1):39-49.

[7] Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc, 2007, 2(12):3081-3089.

[8] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007, 131(5):861-872.

[9] Masaki H, Ishikawa T, Takahashi S, et al. Heterogeneity of pluripotent marker gene expression in colonies generated in human iPS cell induction culture. Stem Cell Res, 2007, (2):105-115.

[10] Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 2007, 448(7151):313-317.

[11] Zhao XY, Li W, Lv Z, et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature, 2009, 461(7260):86-90.

[12] Kang L, Wang J, Zhang Y, et al. iPS cells can support full-termdevelopment of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell, 2009, 5(2):135-138.

[13] Li H, Li Q, Zuo ZY, et al. Analysis of key factors in the karyotyping of iPS cells from human, rat and pig. Chinese J Cell Biol, 2009, 31(3): 443-447. (in Chinese)李辉, 李巧, 左振宇, 等. 人、大鼠和猪诱导多能干细胞染色体制备方法的建立和关键影响因素的分析. 细胞生物学杂志, 2009, 31(3):443-447.

[14] Yan X, George T-J Huang, Zhang FM. Efficiency and interval of iPS cells reprogrammed from dental mesenchyma cells origin. Beijing J Stomatology, 2010, 18(2):61-64. (in Chinese)颜兴, George T-J Huang, 张方明. 牙源性间充质干细胞诱导iPS细胞的效率与时间的研究. 北京口腔医学, 2010,18(2):61-64.

[15] Guo M, Zeng H, Liu LX, et al. Specific inducement of human induced pluripotency stem cells to neuroepithelial cells. Int J Pathol Clin Med, 2010, 30(2):99-105. (in Chinese)郭敏, 曾辉, 柳林欣, 等. 特异性诱导人诱导多能干细胞向神经上皮细胞分化. 国际病理科学与临床杂志, 2010, 30(2):99-105.

[16] Guo M, Zeng H, Liu LX, et al. Specific inducement of human induced pluripotency cells to trophoblast cells. Int J Pathol Clin Med, 2010, 30(2):93-98. (in Chinese)郭敏, 曾辉, 柳林欣, 等. 特异性诱导人诱导多能干细胞向滋养层细胞分化. 国际病理科学与临床杂志, 2010, 30(2):93-98.

[17] Yan X, George T-J Huang, Zhang FM. Cell culture conditions of feeder free for iPS reprogrammed from dental pulp stem cells. Beijing J Stomatology, 2010, 18(3):143-145. (in Chinese)颜兴, George T-J Huang, 张方明. 牙髓干细胞诱导iPS细胞的无饲养细胞培养条件研究. 北京口腔医学, 2010, 18(3):143-145.

[18] Sun XY, Liu HL, Fu XB. Dedifferentiation of epidermal cells into transit amplifying cells induced by bFGF. J South Med Univ, 2010, 30(9):2041-2046. (in Chinese)孙晓艳, 刘惠玲, 付小兵. bFGF诱导表皮细胞去分化形成短暂扩充细胞. 南方医科大学学报, 2010, 30(9):2041-2046.

[19] Xin XL, Lv CR, Chen DM. Construction of recombinant retroviral vector with bovine Klf4 and establishment of a virus producing cell strain. Acta Vet ET Zootechnica Sinica, 2010, 41(12):1636-1641. (in Chinese)辛晓玲, 吕长荣, 陈冬梅, 等. 牛Klf4基因重组反转录病毒载体的构建及产毒细胞株的建立. 畜牧兽医学报, 2010, 41(12):1636-1641.

[20] Li P, Hu HL, Zhang LL, et al. Spontaneous differentiation potency of induced pluripotent stem cells into male germ cells in vitro. National J Androl, 2011, 17(1):8-12. (in Chinese)李朋, 胡洪亮, 张玲玲, 等. 诱导多能干细胞体外向生精细胞自发分化潜能的研究. 中华男科学杂志, 2011, 17(1):8-12.

[21] Xu J, Wang H, Liang T, et al. In vitro induction of mouse meningeal-derived iPS cells into neural-like cells. Chinese Sci Bull, 2011, 56(8):567-572. (in Chinese)许晶, 王皓, 梁涛, 等. 体外诱导脑膜来源的iPS细胞形成神经样的细胞. 科学通报, 2011, 56(8):567-572.

[22] Hu XJ, Lai WY, Wan L, et al. Establishment and characterization of induced pluripotent stem cell line from cdyl knockout mice. J Sun Yat-sen Univ (Med Sci), 2011, 32(2):146-154. (in Chinese)胡晓俊, 赖文玉, 万利, 等. Cdyl基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系的建立及鉴定. 中山大学学报(医学科学版), 2011, 32(2):146-154.

[23] Du LL, Lin G, Lu GX. Comparison of human induced pluripotent stem cells and Oct4/Nanog gene expression in human embryonic stem cell differentiation. Prog Mod Biomed, 2011, 11(1):1-4. (in Chinese)杜丽丽, 林戈, 卢光琇. 人诱导多能干细胞与人胚胎干细胞分化过程中Oct4/Nanog基因表达的比较. 现代生物医学进展, 2011, 11(1): 1-4.

[24] Nelson TJ, Martinez-Fernandez A, Yamada S, et a1. Repair of acute myocardial infarction by human sternness factors induced pluripotent stein cells. Circulation, 2009, 120(5):408-416.

[25] Wernig M, Zhao JP, PruszAK J, et a1. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionallv integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(15):5856-5861.

[26] Liu SV. iPS cells: a more critical review. Stem Cells Dev, 2008, 17(3): 391-397.

[27] Gore A, Li Z, Fung HL, et al. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature, 2011, 471(7336):63-67.

[28] Hussein SM, Batada NN, Vuoristo S, et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature, 2011, 471(7336):58-62.

[29] Lister R, Pelizzola M, Kida YS, et al. Hotspots of aberrant epigenomic reprogramming in human induced pluripotent stem cells. Nature, 2011, 471(7336):68-73.

[30] Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, et al. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature, 2011, 474(7350):212-215.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.015

100020 北京，中国医学科学院医学信息研究所

汪楠，Email：pumcwn@126.com

2011-10-20