胰腺癌干细胞研究进展

朱柱 王春友

·综述与讲座·

胰腺癌干细胞研究进展

朱柱 王春友

数十年来，胰腺癌长期生存率并无显著改善，很大程度上归咎于现有治疗手段忽略了肿瘤的异质性特征。大量研究表明[1-4]，肿瘤由少数肿瘤干细胞和大多数分化细胞组成，前者具有自我更新和分化能力并形成与维持肿瘤，而后者增殖潜能有限。自1997年Bonnet等[1]首先在人类急性粒细胞白血病中发现肿瘤干细胞以来，科学家们已相继在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌等[2-4]实体肿瘤中证实了肿瘤干细胞的存在，同时还发现其与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等特征密切相关。由此可见，胰腺癌干细胞研究对于探讨胰腺癌发病机制及指导临床治疗具有十分重要的意义。

一、胰腺癌干细胞的分离和鉴定

Li等[4]于2007年运用免疫缺陷小鼠移植瘤模型和荧光激活细胞分选法(fluorescence activated cell sorting, FACS)从癌组织中首次分离并鉴定了表型为CD44+CD24+ESA+的胰腺癌干细胞。该亚群在胰腺癌组织中仅占0.2%～0.8%，但成瘤能力为非肿瘤干细胞(CD44-CD24-ESA-)的100倍，接种后形成的肿瘤与原发瘤组织学特征十分相似。此外，该亚群体内连续传代后仍能形成包含CD44+CD24+ESA+和CD44-CD24-ESA-表型的异质性肿瘤细胞，表明其具有自我更新和分化能力。随后，Hermann等[5]应用免疫磁珠细胞分选法(magnetic activated cell sorting, MACS)从癌组织中分离并鉴定了表型为CD133+的胰腺癌干细胞。该亚群约占胰腺癌组织的1.8%，具有极强的成瘤能力，表现为106个CD133-细胞接种后无法成瘤，而106个未分选细胞或仅500个CD133+细胞即可成瘤。体内连续传代后成瘤能力逐渐增强，而且可以产生CD133+和CD133-的异质性肿瘤细胞。

二、细胞系

Gou等[6]运用球培养法富集胰腺癌PANC1细胞系中具有干细胞特性的亚群，发现该亚群能够外排Hoechst 33342染料且连续传代后产生能够外排和无法外排该染料的子代细胞，高表达LY6E、TACSTD1、CD44等干细胞表面标志分子。此外，该亚群成瘤能力较强，5×105个细胞和107个未富集细胞成瘤能力相当。Hermann等[5]在胰腺癌L3.6pl细胞系中分选出占总体比例1%～2%的CD133+亚群，成瘤能力强，表现为103个CD133+即可成瘤，而106个CD133-细胞却无法成瘤。该亚群能够在无血清培养基中增殖产生相同表型的子细胞，而在含血清培养基中分化为成熟的肿瘤细胞，表明其具有干细胞特性。Zhou等[7]运用FACS技术在PANC1细胞系中分选出占总体比例约3%的SP细胞，但未进一步研究其自我更新和分化能力。而新近Kabashima等[8]也在PANC1、KP-1NL 和Capan-2等胰腺癌细胞系中分选出不同比例的SP细胞，具有自我更新和分化能力，表现为能够产生SP和非SP亚群共存的子代细胞。Chambers等[9]应用DNA标记滞留技术在BxPC3和PANC03.27等胰腺癌细胞系中分选出具有干细胞特性的DiI+慢周期细胞亚群(DiI+/SCC)。该亚群不同程度表达CD24、CD44、CD133和ALDH，成瘤能力为DiI-快周期细胞亚群(DiI-/FCC)的10倍。

三、胰腺癌干细胞与侵袭转移

早期侵袭转移(即局部进展和全身扩散)是胰腺癌生物学行为的一个重要特征，导致超过75%的胰腺癌患者就诊时就失去了根治性手术的机会。经典的侵袭转移理论认为，这是一个连续的包含多个步骤的过程，需要肿瘤细胞脱离原发瘤并渗入血液或淋巴循环，体内迁徙后黏附到其他部位进而形成微转移灶和血供，最终形成肉眼可见的转移灶[9-10]。尽管如此，转移实际上是一个极为低效的过程，意味着只有极少一部分肿瘤细胞能够最终形成肉眼可见的转移灶[11]。Luzzi等[12]研究发现，2%肿瘤细胞能够形成微转移灶，但仅0.02%能够最终形成肉眼可见的转移灶。Dembinski等[13]运用Transwell侵袭小室实验发现在BxPC3和PANC03.27细胞系中DiI+/SCC的穿膜细胞数分别是DiI-/FCC 的4和4.5倍，表明具有肿瘤干细胞特性的DiI+/SCC亚群侵袭能力更加显著。Kabashima等[8]应用肝转移模型发现在KP-1NL细胞系中103个SP细胞接种后可发生转移，而5×103个非SP细胞接种后却无法发生，表明具有肿瘤干细胞特性的SP细胞具有更强的转移能力。

近年来大量研究表明，上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)在多种上皮来源的恶性肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用[14-16]，EMT与肿瘤干细胞的关系也愈来愈受到关注。Kabashima等[8]发现，TGF-β调控的EMT过程主要发生在PANC1和KP-1NL细胞系中的SP细胞中。Dembinski等[13]亦发现，BxPC3及PANC03.27细胞系中DiI+/SCC较DiI-/FCC EMT相关分子snail和E-Cadherin表达降低，而twist、vimentin和N-Cadherin表达升高，表明EMT过程主要发生于DiI+/SCC中，说明肿瘤干细胞更容易发生EMT。

“种子与土壤”与“归巢”学说是器官特异性肿瘤转移两大经典理论，其分子机制以基质细胞衍生因子-1/趋化因子受体轴(SDF-1/CXCR4 axis)研究较为深入[17-20]。SDF-1生物学效应主要包括诱导表达CXCR4细胞的趋化反应和黏附作用，促进金属基质蛋白酶(MMPs)和血管形成因子的分泌，促进肿瘤细胞的生长和侵袭。Hermann等[5]从L3.6pl细胞系中分选出CD133+CXCR4+和CD133+CXCR4-两个亚群后发现两者成瘤能力没有差异，但仅前者能够发生肝转移，且应用CXCR4抑制剂AMD3100后可以显著减少肿瘤转移。此外来源于患者癌组织的CD133+亚群CXCR4表达率高者侵袭能力强，肿瘤患者临床分期晚。该研究首次提出“转移性肿瘤干细胞”概念，表明其迁移，特别是器官特异性转移主要通过激活CXCR4实现，从新的角度阐释了SDF/CXCR4轴在胰腺癌肝转移中的作用。

四、胰腺癌干细胞与放化疗抵抗

放化疗抵抗是肿瘤干细胞基本特征之一，原因包括凋亡和DNA损伤抵抗等。多项研究表明，胰腺癌干细胞很可能也对放化疗抵抗。Shah等[21]从L3.6pl和AsPC-1细胞系中筛选出吉西他滨抵抗的胰腺癌细胞株，形态和功能上都发生了EMT，且干细胞标志CD44、CD24和ESA表达均显著增加。Lee等[22]发现放化疗能够富集来源于癌组织的CD44+CD24+ESA+亚群。Hermann等[5]也发现L3.6pl细胞系和癌组织中CD133+亚群较CD133-亚群耐药更加显著，且延长化疗后前者出现富集现象。同样，Dembinski等[13]发现5-FU和吉西他滨标准治疗后存活的DiI+/SCC在撤去化疗药物后继续分裂增殖为包含DiI+/SCC和DiI-/FCC的异质性肿瘤细胞。此外， 在成体干细胞和肿瘤中都过度表达的ATP结合盒转运载体蛋白(ATP-binding cassette proteins, ABCG)可以介导药物外排进而导致多药耐药和SP表型的出现，在肿瘤干细胞的化疗抵抗中发挥重要作用[23]。Zhou等[7]发现FACS分选PANC1细胞系后得到的SP细胞中ABCG1与ABCG2的表达水平为非SP细胞的20余倍，进一步证实了上述观点。

五、胰腺癌干细胞相关信号通路与靶向治疗

新近研究证实，胰腺癌干细胞中多种信号通路表达与调控异常，包括SHH、Bmi-1、TGF-β、EGFR等[4,13,22]。Li等[4]发现SHH在胰腺癌细胞、CD44-CD24-ESA-和CD44+CD24+ESA+亚群中的表达水平依次是正常胰腺上皮细胞的4.1、4.0和40.6倍。与此同时，Lee等[22]也发现Bmi-1在正常胰腺上皮细胞和CD44-CD24-ESA-亚群中的表达没有差异，而在CD44+CD24+ESA+亚群中的表达约为正常胰腺上皮细胞的7倍。此外，Dembinski等[13]观察到与未分选胰腺癌细胞系相比，DiI+/SCC亚群中TGF-β1表达上调，而EGFR则与之相反。因此，针对胰腺癌干细胞中异常表达与调控的信号通路进行靶向治疗具有十分重大的意义。Mueller等[24]联合应用SHH抑制剂环王巴明、mTOR阻断剂雷帕霉素和吉西他滨化疗使胰腺癌体内与体外模型中的肿瘤干细胞减少至无法检测的水平，表明传统化疗配合肿瘤干细胞靶向治疗极有可能彻底改变胰腺癌患者的预后。

六、问题与展望

胰腺癌干细胞理论从新的角度阐述了胰腺癌的发病机制，为临床治疗提供了新的突破口。胰腺癌干细胞表面标志包括CD44、CD24、ESA、CD133和CXCR4，功能标志包括SP与DiI。这些标志物的产生与干细胞的谱系发育过程及其生物学行为之间的关系尚不明确。应用转基因及敲基因工程小鼠建立胰腺癌模型，分析不同时期相关标志的表达，有利于明确肿瘤干细胞的动态演变和生物学行为的关系。肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞或正常干细胞在基因和蛋白表达谱及相关信号通路表达和调控有何差异还有待进一步研究。倘若我们能够发现特异性的标志分子或者信号通路，将有助于开发有效的早期检测方法、精准的靶向治疗药物以及科学合理监测复发和转移的手段。此外，明确SP细胞在胰腺癌耐药中发挥的作用，将为未来抗癌药物的开发与药效评价提供坚实的理论基础。

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2010-01-11)

(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.027

430022 湖北武汉，华中科技大学附属协和医院胰腺外科中心

王春友，Email: chunyouwang52@126.com