重症急性胰腺炎患者肠黏膜通透性的高压液相色谱-示差法检测

黄宏春 王秀敏 胡琳琳

重症急性胰腺炎患者肠黏膜通透性的高压液相色谱-示差法检测

黄宏春 王秀敏 胡琳琳

肠黏膜屏障功能破坏、肠源性细菌易位是重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)继发感染以及引起全身炎症反应综合征(SIRS)及多脏器功能不全综合征(MODS)的主要致病机制[1-3]。但目前尚缺乏检测SAP肠黏膜屏障功能的有效方法。本文采用高压液相色谱-示差法检测SAP患者口服糖分子探针乳果糖(LAC)、甘露醇(MAN)后尿液排泄率比值(LAC/MAN)，评估患者肠黏膜屏障功能，现报道如下。

一、材料和方法

1．研究对象：46例SAP患者均为2008年1月至2009年8月我院住院患者，男33例，女13例，年龄21～77岁，平均(56±14)岁。同时以25例本院健康职工作为健康对照组。SAP诊断符合中华医学会消化病分会胰腺病学组制定的标准[4]。

2．肠黏膜屏障功能的检测：受试者于住院次日晨起排空尿液后空腹经胃肠减压管注入糖溶液(100 ml双蒸水,5 g甘露醇,10 g乳果糖)。收集6 h尿液，计总量；取10 ml加少量防腐剂(硫柳汞：0.2 mg/ml)，置离心管，封口，-85°C保存待测。参考文献[5]，采用高压液相色谱仪(日本岛津公司，LC-6A，配备RID-6A示差检测器)检测SAP患者尿液LAC/MAN，评估患者肠黏膜通透性。色谱条件：色谱柱为Nucleosil(美国)NH2柱，10 μm (4.6 mm×250 mm id)；流动相为乙腈-水(70∶30，v/v)，流速1 ml/min；柱温35℃；示差检测器内加热温度为37℃，时间常数为1.0。

将冰冻贮存样品解冻、混匀，取5 ml 3000 r/min离心10 min，取上清液3 ml加5%醋酸2～3滴加热煮沸，冷却后再5000 r/min离心10 min，取上清液2 ml经阴阳离子交换树脂去除离子、0.22 μl滤器过滤后，取0.2 ml尿样品从进样口注入HPLC仪，由切换阀自动进样20 μl；当听到进样的声音以后立即开始记录，直至待测峰全部出现、基线平稳后停止记录。

以同样处理后的正常尿液，加入5、10、25、50、100、200、500、1000 μg/ml的LAC和MAN。每样浓度进样3次。根据峰面积(R)与相应的浓度(C)进行线性回归，得回归方程。依据样本的R计算C。

二、结果

标准溶液及样本的色谱图见图1。

a:标准溶液；b:标本；1:甘露醇；2：乳果糖

对照组尿液LAC%、MAN%及LAC/MAN值的变化分别为(0.175±0.010)%、(8.37±0.70)%及0.022±0.003；SAP患者分别为(0.719±0.04)%、(7.41±0.44)%及0.101±0.005。SAP患者尿液LAC%、LAC/MAN比值均显著高于健康对照组(P值均<0.001)。

讨论肠黏膜通透性是指肠黏膜上皮容易被某些分子物质以简单扩散的方式通过的特性[3]。多项动物实验和临床研究均证实，在多种急危重病状态下，肠黏膜通透性是增加的，且往往与病情轻重相关[1-3]。

目前临床和实验研究中用于测定肠黏膜通透性的分子探针主要有以下几类：糖分子探针、同位素探针、聚乙二醇类分子探针(PEGS)[5-6]，其中测定LAC/MAN值是一种无创有效的方法，并可排除一些非特异因素，如胃排空、肠蠕动、肠黏膜表面积、心排出量和肾清除能力的影响，是目前公认的检测肠黏膜通透性较好的方法。一般认为，LAC的通透性可反映肠黏膜的屏障功能，而MAN主要反映肠道的表面积[5-7]。

本试验结果显示，SAP患者LAC排泄率显著升高，MAN排泄率无明显改变。提示SAP可导致肠壁黏膜水肿，细胞间紧密连接发生水肿，与近期的动物实验结果相符[7]。

双糖试验的方法有很多。薄层色谱法是一种耗时、半定量的方法；气-液色谱法需要复杂的柱前衍生；高压液相色谱法省时，稳定性好，可靠性高，仪器较普及，易于推广[8]。本结果亦证实高压液相色谱法进行双糖试验是检测SAP患者肠黏膜通透性有效、可靠的方法。

[1] 程礼, 王兴鹏, 汪佩文, 等. 保护肠屏障功能对重症急性胰腺炎患者预后的影响. 胃肠病学,2005,10: 24-26.

[2] 王兴鹏, 龚自华.急性胰腺炎的发病机制新概念∥王兴鹏.现代胃肠病学.上海: 上海科学技术文献出版社,2001：90-108.

[3] 武金宝,王继德,张亚历.肠粘膜屏障研究进展.世界华人消化杂志,2003,11:619-623.

[4] 中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组.中国急性胰腺炎诊治指南(草案).胃肠病学,2004,9; 110-112.

[5] Kazunori M, Ross B, David M, et al. Rapid and simultaneous quantification of rhamnose mannitol and lactulose in urine by HPLC for estimating intestinal permeability in pediatric practice. Clinicl Chem,1996,42: 71-75.

[6] 王兴鹏.急性胰腺炎实验与临床研究现状∥袁耀宗, 王兴鹏.胰腺病学新进展与新技术.上海: 上海科学技术文献出版社,2001:106-127.

[7] 谷俊朝,周晓娜,王拒,等.谷氨酞胺对重症急性胰腺炎大鼠肠道损伤影响的实验研究.中华肝胆外科杂志,2006,12,757-760.

[8] 邓高月，刘振邦，徐燕英，等.高压液相用于肠通透性的测定.中国微生态杂志,2000,12：242-244.

2009-10-09)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.020

455000 安阳，河南省安阳市人民医院消化内科