与大肠癌分化相关的基因标记物

甘 毅， 陈道瑾， 邹 琼， 李小荣

大肠癌是常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势［1］，其分化程度对肿瘤生长、侵袭、转移和预后都有着重要影响。分化是肿瘤的一种生物学特征，分化程度是指肿瘤细胞接近正常细胞的程度，分化得越好(高分化)，意味着肿瘤细胞越接近相应的正常发源组织，而分化越低(低分化或未分化)，细胞和相应正常发源组织区别越大。分化差的肿瘤，恶性度高，生长迅速，容易发生转移。目前发现在大肠癌组织中，存在一些与分化相关的肿瘤基因及标记物，检测其表达与否及表达水平的高低将有助于评估病情和预后。本文依据功能不同从癌基因、抑癌基因两方面进行综述。

1 癌基因及标记物

肿瘤的发生是原癌基因激活和抑癌基因失活共同作用的结果［2］。癌基因能使正常细胞发生恶性转化，其编码的蛋白一般与细胞增殖有关，是细胞生长发育中不可缺少的功能性基因。大多数情况下，癌基因处于不表达或低表达状态，不会引起细胞恶变，故也称“原癌基因”。当原癌基因在理化等因素的作用下发生突变、易位、扩增等改变时，可被激活成癌基因，导致正常细胞失控，出现恶变或异常增生。与大肠癌分化相关的癌基因有ras、myc等。

1.1 ras基因 ras基因是一种原癌基因，首先发现于大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma)，调控细胞的生长和分化，其的激活是人体肿瘤发生过程中最常见的基因异常。ras基因可分为 K-ras、H-ras和 N-ras基因［3］，共同编码的一种蛋白——P21参与细胞内的信号转导。在大肠癌组织中，K-ras基因突变占主导地位，是最常发生突变的原癌基因［4］，也被认为是黏膜上皮癌变的一个早期步骤［5］。Fransen等［6］认为，ras基因突变导致ras-mRNA转录加速，ras蛋白合成增加，细胞自发或过度传递生长信号，造成生长紊乱及肿瘤产生。陈大伟等［7］用免疫组化法检测92例大肠癌组织中ras蛋白，认为ras蛋白表达与大肠癌生物学行为及大肠癌预后相关。ras蛋白在高、中、低分化大肠癌的表达率分别是 44.44%、56.13%、85.71%，显示随着癌细胞分化程度的降低，ras蛋白表达率逐渐升高，且高、低分化之间的差异有统计学意义(P＜0.05)。综上，检测ras基因突变情况对大肠肿瘤的治疗和预后监测具有一定的指导意义。

1.2 myc基因 myc基因(myelocytomatosis oncogene)，即髓细胞增生原癌基因，属核转录因子类原癌基因，其编码的蛋白质在核内对DNA转录实施调控，影响细胞增殖及肿瘤发生［8］。myc基因包括C-myc、N-myc、L-myc，C-myc 基因一般与细胞的生长状态有关，其扩增和过度表达与肿瘤发生与转归密切相关，在细胞增生过程中，C-myc可促使细胞从G0期进入G1期，进而细胞由静止期激活至S期并进行DNA合成，调节细胞生长、分化或向恶性转化。当细胞分化完成，C-myc表达降低。在人类的肿瘤中，常有 C-myc基因的过度表达、扩增或重排。Mosnier等［9］报道约2/3大肠癌组织myc的 mRNA表达较正常黏膜高3～24倍。另外，C-myc基因表达增强常提示大肠癌组织分化较低，预后不良。Heerdt等［10］检测结肠癌的C-myc表达，结果显示在黏液型和低分化型中C-myc高表达率占53.8%和42.3%，而中分化及高分化型的C-myc高表达率仅为6.9%，认为在大肠瘤进展过程中存在C-myc基因堆积。宫桂华等［11］应用DNA斑点杂交技术对44例大肠癌及相邻正常黏膜组织进行C-myc基因扩增分析，发现大肠癌组织中C-myc基因扩增率为61.4%，并与分化程度密切相关，其中黏液腺癌与低分化腺癌的扩增率分别为84.6%和71.4%，明显高于高分化腺癌(45.8%，P ＜0.05)，提示 C-myc基因扩增可使肿瘤恶性程度增加。余志龙等［12］采用免疫组化Elivison法，发现C-myc在结肠癌和正常结肠黏膜组织中的表达差异显著，其表达在癌细胞分化程度、转移及分期上也有显著差异(P＜0.05)，认为C-myc蛋白高表达对判断直肠癌预后及转移有重要参考价值。

2 抑癌基因及标记物

抑癌基因是正常细胞中存在的一类可抑制细胞生长和增殖分裂的基因，激活时可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。其能对癌基因表达进行负调节，阻抑细胞的癌变。当抑癌基因发生抑制或丢失后，可导致肿瘤发生。

2.1 大肠癌缺失基因 大肠癌缺失基因(deleted in coloretal cancer，DCC)是目前序列最长的抑癌基因，其表达产物为跨膜磷蛋白——DCC蛋白。DCC基因、DCC mRNA和DCC蛋白在正常大肠黏膜均为阳性表达，而在大肠肿瘤中，其表达常减少或缺失，特别在肿瘤晚期［13］。Fearon 等［14］发现，大肠癌中随着恶性程度提高，DCC基因缺失率随之上升。郭伟等［15］采用RT-PCR和免疫组化法，发现大肠正常黏膜DCC mRNA缺失率为0%，腺瘤DCC mRNA缺失率为11.1%，腺癌的缺失率为 60.6%(P ＜0.01)。此外，DCCmRNA缺失率还与大肠肿瘤分化程度相关，高分化腺癌DCC mRNA的缺失率为60.6%，低分化腺癌中缺失率则升高为85.0%，显示 DCC mRNA表达缺失与癌细胞分化之间存在显著相关性(P ＜0.01)。Saito等［16］应用 western blot和免疫组化法研究23例结肠癌标本，发现肿瘤中DCC基因缺失率为(66.7%)，其编码产物DCC蛋白在癌组织中的表达水平比在癌旁正常黏膜和腺瘤中都显著下降，并与肿瘤分化类型和远处转移显著相关(P＜0.01)，DCC蛋白缺失的患者有更高的复发率和更低的5年生存率(P＜0.01)，提示DCC蛋白在肿瘤的进展和预后中起重要作用。此外，徐美东等［17］采用免疫组化Envision TM法检测大肠癌中DCC蛋白表达，显示正常黏膜中阳性率为100%，癌组织中阳性率仅56.1%，且其表达与肿瘤的分化、术后转移、5年生存率有相关性(P＜0.05)，分化越低，缺失率越高，认为DCC表达水平可作为大肠癌独立的预后因素，DCC基因的表达缺失可以作为判断大肠癌转移潜能及预后的独立指标。

2.2 p16基因 p16基因是1994年发现的一种抑癌基因，又称多肿瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor 1，MTS1)，直接参与调控细胞周期，负调节细胞增殖及分裂。正常细胞在分裂增殖周期中，G1期→S期和G2期→M期是2个主要的时期转换点。p16基因编码的P16蛋白可结合细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)并使其失活，阻碍细胞从G1期进入S期，从而阻止细胞增生和增殖［18］。一旦p16基因发生缺失、突变，即可导致P16蛋白合成障碍，细胞增殖将失控并可能导致恶性肿瘤的发生［19］。p16基因和P16蛋白无论在体内还是体外均有抑制和调控大肠癌细胞增殖的作用［18］。王石等［20］采用免疫组化SP法检测正常黏膜与大肠癌组织中P16蛋白的表达，显示癌组织P16蛋白阳性率显著低于正常肠黏膜(P＜0.05)，且P16蛋白表达与分化程度、淋巴结转移和Duke's分期等密切相关(P＜0.05)，认为P16蛋白在大肠癌组织中表达下调，且P16蛋白表达与大肠癌的临床病理特征密切相关。黄玉新等［21］采用免疫组化ABC法，检测在正常大肠组织和大肠癌组织中P16蛋白的阳性率分别为75.0%和35.7%(P＜0.01)，P16蛋白表达随着肿瘤组织分化程度的降低而减弱，阳性表达率有显著性差异(P＜0.05)，认为P16蛋白表达缺失与肿瘤分化不良有关(r=0.3383，P ＜0.05)，有助于判断肿瘤分化程度及估计预后。其他研究实验也取得了相似结果［22］。张红等［23］采用免疫组化法，发现大肠癌组织中P16蛋白阳性表达率与分化程度相关，低分化癌的P16蛋白阳性率明显低于高分化癌(P＜0.05)，在5例黏液癌及2例未分化癌中无1例表达(P＜0.01)，提示P16蛋白表达缺失与大肠癌的分化程度密切相关。马晋平等［24］应用半定量多重PCR法检测p16基因的纯合缺失情况，结果发现结肠癌p16基因纯合缺失时均为低分化腺癌，显示p16基因异常与胃肠道恶性肿瘤的生物学行为有一定的意义。

2.3 nm23基因 nm23基因不是抑癌基因，但却具有抑制肿瘤细胞侵袭和转移表型的功能，属于肿瘤转移抑制基因(tumor metastasis suppressor gene，non-metastasis)，最早于1988年由美国Steeg发现，其编码的蛋白酶能够直接或间接地抑制具有促进转移作用的蛋白，从而降低癌细胞的侵袭和转移能力。nm23基因蛋白通过影响微管聚合及磷脂酰肌醇信号传递途径来调节细胞代谢，对肿瘤的增殖、分化、侵袭及转移起重要的作用［25］。目前已发现5种nm23基因，分别为 nm23-H1、nm23-H2、nm23-H3、nm23-H4和nm23-H5，研究最多的是nm23-H1。在体外实验中，如将结肠肿瘤细胞株nm23-H1基因表达进行“沉默”，可促进肿瘤细胞的转移、游走和侵袭［25］。郑鹏才等［26］报道 nm23-H1 在大肠癌中的表达与分化有关，在高分化大肠癌中，nm23-H1基因阳性率可达85%，在未分化大肠癌中阳性表达率仅20%(P ＜0.001)。曹永等［27］采用免疫组化 SP 法检测结肠癌和正常黏膜组织，发现nm23在大肠癌中的表达与淋巴结转移、分化程度、Duke's分期有明显相关性(P＜0.01)，认为nm23的表达与结肠癌侵袭转移密切相关，可作为判断结肠癌预后的指标。邵国安等［28］研究在结肠癌、结肠腺瘤和癌旁正常结肠黏膜组织中nm23-H1的表达，显示nm23-H1的表达在结肠癌、结肠腺瘤和正常结肠黏膜组织中差异有显著性(P＜0.01)，分化程度低的结肠癌组织中nm23-H1表达率低于分化程度高的结肠癌组织。

3 结论

肿瘤的分化是涉及到一系列多步骤的复杂过程，各种肿瘤基因及其表达产物可能在其中发挥了重要的功能。研究和检测他们在肿瘤组织内的表达，有助于给疾病诊断和评估预后提供新的思路，可能作为对传统病理检查方法的一种有益补充。当前面临的主要问题是各种检测方法尚未标准化和自动化，各项检测的价格昂贵，因此，大规模的临床应用还有待时日。我们期待将来会有经济、客观、准确和自动化的检测方法或仪器出现，在一定程度上能替代传统的病理切片方法来完成对标本的病理诊断和分化判定，这也是我们临床工作者共同努力的方向。

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