多药耐药基因多态性与乳腺癌化疗关系的研究进展

唐金海

肿瘤的多药耐药(multidrug resistant，MDR)是指肿瘤细胞在接触了一种抗肿瘤药物并出现抗药性的同时，对其他结构不同、作用部位不同的药物也产生交叉耐药的现象，是导致肿瘤化疗失败的最主要原因。MDR可有2种不同的表型，一种是对第1次治疗即产生耐药，称天然耐药(natural resistance);另一种是在治疗过程中产生耐药，称获得性耐药(acquired resistance)。在乳腺癌中通常以后者更为常见。肿瘤多药耐药的机制十分复杂，目前还未完全阐明，可能涉及细胞内药物浓度降低、药物靶分子改变及代谢解毒、细胞DNA损伤修复和抗凋亡功能增强等多种机理，但最被临床认可的、研究也较为深入的是多药耐药基因MDR1及其编码产物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的作用。为此，本文就近年来有关MDR1遗传多态及其表达对乳腺癌化疗和预后的影响以及MDR1介导耐药的逆转等作一综述。

1 MDR1及其编码蛋白

人类多药耐药基因MDR1定位于染色体7q21.1，含有 28 个外显子，全长 4.5 kb，编码 1 280个氨基酸，分子量约为170 ku。人类基因组中包含MDR1和MDR2两个MDR基因，但只有MDR1介导多药耐药。MDR1编码产物P-糖蛋白是首个被发现的ATP结合盒(ATP binding cassette，ABC)膜转运蛋白超家族中的成员，在人类药物转运和处置中所起的作用也最重要，有研究表明P-gp可能与乳腺癌的获得性耐药有关;其可将细胞内底物包括多种抗癌药物泵出胞外，使细胞内药物积聚浓度下降，从而产生多药耐药［1］。另有研究显示MDR细胞株具有凋亡抗性，P-gp能延缓凋亡“瀑布”的出现以协同MDR;这主要是因为P-gp除了作为药物外排泵外，还能通过抑制Caspase-3和Caspase-8的激活，阻断大多数抗癌药物诱导细胞凋亡的核心通路“Caspase依赖性细胞凋亡”。

现已明确MDR1基因突变引起的单核苷酸多态性(SNP)可以改变P-gp的表达和功能，而P-gp在肿瘤细胞表面的过表达被认为是介导MDR的重要基础。因此有研究者提出，MDR1/P-gp的功能和关系的研究必将有助于临床肿瘤化疗反应及其预后的预告和监测［2］。

2 MDR1多态性及其种族间差异

同种疾病相同剂量的药物可以在人群或个体间产生异质性很大的疗效及毒副反应，遗传因素在其中有重要的决定作用。迄今为止，在MDR1基因中共发现50多个遗传多态性，其中19个位于外显子区域，8个位于内含子区域，11个位点SNP没有引起氨基酸改变为非同义突变。在这些突变位点中，第12外显子C1236T、第21外显子G2677T/A和第26外显子C3435T被发现具有重要的功能意义。G2677T/A多态可引起氨基酸被置换(Ala893Ser)，导致P-gp蛋白结构发生变化;C3435T和C1236T多态也位于编码区，虽不引起氨基酸改变，但与蛋白折叠或功能的改变相关［3］。

近年来的研究已证实MDR1基因多态分布存在明显的种族差异，对其研究有助于解释不同群体对药物代谢和效应差异的遗传本质，同时也可为临床针对人群或个体患者的药物配给及其剂量选择提供重要信息。梁剑宁等［4］研究汉族人 MDR1 C3435T多态分布，发现汉族人的突变频率为34.7%，高于非洲人(16%)，低于欧洲高加索人(48%)，与日本人和菲律宾人接近(39%)，说明中国汉族人MDR1基因的多态分布具有自己的特点。赖泳等［5］对中国143名佤族、138名白族和257名藏族健康个体进行MDR1 C3435T基因分型，结果显示三族之间基因型和等位基因频率均无差异;C3435T等位基因T在佤族、白族和藏族的频率分别为46.2%、44.9% 和 45.9%，与非洲裔美国人比较有明显差异，而佤族和藏族与汉族比较也有差异。另有文献报道C1236T及G2677T/A在非洲和美洲人群中表达较高，C1236T在高加索和日本人中的发生率分别为 34.4%和 14.6%，有显著差异［6］。

MDR1最常见的单体型是由 C3435T与G2677T/A和/或C1236T组成，三者之间紧密的连锁不均衡性已在多个研究中得到证实。由于C3435T的变异频率随着种族不同而变化，因而携带该SNP的单体型也存在着相似的种族分布变化:非洲人以野生C-G-C等位基因占优势(C-G-C约70%，T-T-T约6.5%)，高加索人野生C-G-C和突变T-T-T一致(均40%)，而在印度人中，突变T-T-T相对占优势(T-T-T 约35%，C-G-C 约20%)［1］。

MDR1基因多态的这种种族分布差异可明显影响药物的处置。如Min等［7］报道不同种族的人群有不同的环孢素(P-gp转运底物)生物利用率，白种人为 39.6%、黑种人为 30.9%(P=0.048);环孢素的清除率，在美国白人和美国黑人之间也有明显的种族差异(P=0.0001)。

3 MDR1多态性与P-gp表达/功能的关系

MDR1多态性可通过改变基因的表达水平或P-gp蛋白的功能，最终影响药物的体内代谢和效应。目前这方面的研究主要集中在C3435T上，并已证实该位点与P-gp的表达或功能有关，但在基因型与表型的关系上存在着明显分歧，目前也无确切的解释。2000年Hoffimeyers等［8］首次报道MDR1基因多态性与人类 P-gp表达相关，发现在白人中3435TT型个体十二指肠 P-gp的表达水平仅为3435CC型个体的33%，且 P-gp的低表达导致了3435TT型个体地高辛血浆药物浓度的增高，由此引发广泛关注。一些学者针对不同种族人群开展了类似的研究，但结论却不一致。如Johne等［9］报道在白种人中3435TT基因型导致P-gp表达降低和地高辛血浆浓度升高;Taheri等［2］对伊朗乳腺癌人群的研究也发现TT基因型P-gp表达水平明显低于CT和CC型，均支持上述报道。而Gerloff等［10］的研究则认为携有3435T和3435C等位基因的健康高加索人P-gp表达和地高辛血浆浓度并无区别;但一项针对日本人群的研究结果却相反，Nakamura等［11］在定量检测十二指肠 MDR1表达时发现，携带3435T等位基因的日本正常人群MDR1 mRNA表达水平明显高于C等位基因者。为此，姜志平等［12］对Pubmed来源的14篇“MDR1 C3435T基因多态性对环孢素体内代谢影响”的报道，进行荟萃分析，结果认为C3435T基因型和表型间的相关性可能存在种族差异。

另外，C3435T并非影响MDR1表达功能的唯一位点，多个SNP的联合作用参与的途径可能也需要考虑;如 Horinouchi等［13］研究认为 C3435T突变所导致的P-gp表达和功能改变，可能是因为其与G2677T的连锁而得以借助G2677T错义突变来实现。Vaclavikova等［14］研究发现 79.5%的乳腺癌组织中MDR1基因表达水平比非癌组织有所下调，认为与C3435T和C1236T的多态性有关。MDR1单体型分析可能有助于我们对单个SNP产生的不一致研究结果以及MDR1遗传多态和功能复杂关系的全面理解。

4 MDR1多态性与乳腺癌化疗或预后的关系

近年来随着药物基因组学的发展，有关MDR1多态性与乳腺癌疗效、毒副反应以及预后的关系研究有了较大进展。Rodrigues等［15］研究发现化疗后病理完全缓解的乳腺癌患者全部携带3435 CT或TT基因，没有1例为 CC纯合型。而 Cizmarikova等［16］的研究结果却相反:携带3435 C等位基因的患者比T等位基因的患者有更高的化疗反应率;CC纯合型患者的中位进展时间为121.8个月，CT和TT型患者的中位进展时间为43.25个月，两者间差异显著。Chang等［17］针对转移性乳腺癌的研究虽未发现C3435T与耐药的关联，但发现CT型患者总的生存期短于CC型。我们的实验室研究(待发表)也发现乳腺癌患者C3435T变异与紫杉醇联合蒽环类药物的新辅助化疗疗效相关;TT基因型疗效明显低于C等位基因携带者，与日本、中国和韩国等亚洲人群的大部分研究结果相似［11，18-20］。另外，新近有研究认为MDR1单体型分析，可能比单相多态性具有更好的表型相关性。如 Lal等［21］研究发现C1236T、G2677T/A和C3435T的CC-GG-CC野生型患者与CT-GT-CT和TT-TT-TT变异型相比，体内多西紫杉醇清除明显增高而血浆药物峰浓度明显下降;不过，Pan等［18］却发现 2677G-3435C 单体型预示中国汉族非小细胞肺癌患者具有更好的紫杉醇-顺铂化疗反应率。这些均提示，上述不同种族中可能存在的多态性与表型的不同关系，最终可能对疗效也产生其种族特有的影响，值得进一步研究。

另外，在化疗毒副反应方面，MDR1遗传多态分析可能也具有一定的预测价值。如Tran等［22］发现MDR1 C3435T的TT、TC和CC型乳腺癌患者Ⅲ度白细胞减少症的发生频率分别为100%、77.3%和54.5%，推测C3435T多态性与化疗毒副反应有关。Tsai等［23］发现在台湾乳腺癌患者中2677GG型比携带变异型患者更易于出现发热和白细胞减少。

5 MDR1基因和蛋白表达与化疗及预后的关系

P-gp是人体许多正常组织中的正常蛋白，主要分布在具有排泄和分泌功能的细胞如肝脏、肾脏、小肠、胎盘、血脑屏障和造血干细胞中;可将有害的代谢物和外源性物质主动排出，保护细胞免受损害。在耐药癌细胞、化疗耐受患者的癌组织以及各种体外构建的MDR细胞培养模型中P-gp/MDR1均呈高表达，且表达水平与耐药程度呈明显正相关。

临床检测显示，未经治疗的乳腺癌患者癌组织中MDR1/P-gp表达率在26.0% ～67.5%，说明有相当一部分患者在治疗前就已经有MDR的存在，表达MDR1的乳腺癌患者对MDR相关的化学药物反应差，且与乳腺癌的分期、复发和预后也存在一定的关联。杨晓文等［24］采用免疫组化法检测乳腺癌组织P-gp的表达情况，发现28例新辅助化疗患者，化疗前癌组织P-pg的表达程度与56例乳腺癌未化疗者癌组织相似，但在化疗后P-gp的表达水平明显升高，推测化疗药物会诱导P-gp蛋白的表达，因此检测MDR1表达水平对临床选择化疗方案具有重要意义，可将其作为制定化疗方案和判断预后的参考标准。

6 MDR1/P-gp多药耐药的逆转

P-gp逆转策略主要有(1)P-gp逆转剂，通过特异性或竞争性地与P-gp结合来达到逆转目的;(2)免疫治疗，利用特异性抗体封闭 P-gp功能，如MRK16等;(3)基因治疗，包括核酶技术、反义核酸技术和小分子干扰RNA技术等，在基因水平阻断MDR1的作用。

目前，P-gp逆转剂已经发展到第三代。第一、二代逆转剂由于自身的剂量限制性毒性，或者与抗癌药合用时干扰后者的药代动力学，限制了其临床应用。第三代逆转剂有 S9788、XR9576和GF120918等，基本克服了以上缺点。如S9788是近年来发现的新型氨基哌啶类逆转剂，临床Ⅰ期试验结果显示，其发挥抑制P-gp泵功能的剂量，与阿霉素之间无药代动力学方面的相互影响，不增加后者的毒性;此外中药逆转剂在逆转耐药方面也显示出一定的效力，但他们的临床效果还有待研究。

肿瘤细胞产生多药耐药的最主要原因是MDR1基因的过度表达以致其编码蛋白的大量增加，因此，在基因水平逆转MDR是解决此问题的根本。新近，小分子RNA(SiRNA)干扰技术的发展为肿瘤多药耐药逆转提供了靶向性更强、逆转效果更佳的技术手段［25］。一系列体外耐药细胞模型的实验研究均证实，通过RNA干扰能够稳定而持久地“沉默”耐药肿瘤细胞中MDR1基因的表达，成功克服P-gp介导的耐药性，为肿瘤耐药治疗带来了新希望。

7 结语

虽然绝大多数研究认为MDR1 C3435T变异在调节P-gp表达或功能上具有重要作用，但其调节机制以及最终对表达或药效影响的结果目前均未能完全阐明;其他已知的SNPs及其单体型对P-gp蛋白表达或功能的影响，或不太明确或未能显示明显意义。其原因可能为:(1)存在种族差异，各种族间甚至同一种族不同地区间都存在MDR1多态性以及基因型与表型关系的差异;(2)研究位点较局限，除了C3435T、G2677T/A和C1236T外，还应发掘更新的位点并加强对单体型的研究;(3)单个SNP的影响可能较小，需要连锁或联合分析;(4)MDR1基因和蛋白表达的影响因素很多，如药物相互作用和环境因素也很重要。为此，我们认为，在目前状况下，不同人群MDR1遗传多态和表型的联合检测与分析在临床肿瘤化疗耐药或疗效预测上可能更重要，我们也正在开展这方面的研究。由于肿瘤MDR是多种耐药基因参与和不同机制共同作用的结果，因此耐药相关多个通路上的基因及其SNPs的联合检测及表达谱的分析也需重视。如最近Stege等［25］报道在MCF-7乳腺癌细胞多种耐药亚群中转录因子ETS1基因均呈高表达，并认为ETS1是通过上调MDR1的表达来诱导MDR的。

当然，在对上述MDR分子机制的全面认识以及耐药准确预测的基础上，有效开展MDR逆转，也是临床化疗中亟待解决的问题。目前针对MDR的基因治疗仍处于探索阶段，在基因载体的选择、靶基因在靶细胞内的特异性表达及基因治疗生物安全性等方面还存在许多有待解决的问题。相信随着这些问题的解决，多药耐药将不再是肿瘤药物治疗的障碍。

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