高原低氧对大鼠大脑皮质生长休止蛋白7表达的影响

李晓恒 孙朝越 胡红梅 杨赣军 孙 弋 彭建安 廖家万＊

(1井冈山大学医学院组织胚胎学教研室,江西343300; 2深圳市疾病预防控制中心 广东518055)

生长休止蛋白7(Gas7)属于生长休止基因家族的一员,是一种与细胞分化和活化相关的重要调节子[1]。研究表明 Gas7主要表达在大脑皮质、小脑、海马等部位[2,3],在某些条件下,它可诱导胚胎干细胞[4]、PC12细胞或神经瘤细胞向成熟和终末方向发育和分化[5,6];Gas7还具有潜在的神经保护作用以抑制神经毒素对神经元的损伤,同时 Gas7在神经系统过度表达可导致神经突起异常增生[6]。由于中枢神经系统对氧非常敏感,在高原低氧环境下中枢神经系统会受到一定的损害,有研究表明缺氧可促进细胞凋亡和坏死[7]。实验运用免疫组织化学、Western-blot技术检测 Gas7在大脑皮质中的表达变化,进一步探讨低氧对大脑皮质神经元的影响过程中Gas7的可能作用。

材料和方法

1.实 验动物分组和动物模型的制备

成年雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)36只,体重240g左右,将动物随机分为2组:(1)正常对照组(n=18);(2)缺氧组(n=18)。

缺氧组大鼠置于低氧箱内,调节箱内氧浓度为8%,每天缺氧8h,持续6周。正常组除不缺氧外,其它饲养条件与缺氧组相同。

2.免 疫组织化学测定

2.1 标本的制备

取实验组和对照组大鼠各9只,经7%水合氯醛腹腔注射麻醉后,行开胸经左心室至升主动脉插管,先用37℃生理盐水100ml快速灌流冲洗血液,再用预冷的含4%多聚甲醛的0.1mol/LPB(p H7.4)300ml作灌流固定。取脑并修取大脑顶端在上述固定液中后固定约 6-8 h(4℃),再用0.1mol/L PB(p H7.4)浸洗两次后,常规上行酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。然后用石蜡切片机行连续冠状切片,片厚5μm,贴于硌矾-明胶载片,烤干备用

2.2 免疫组织化学反应

Gas7免疫组织化学染色:切片常规脱蜡入水,0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,3%牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性反应,羊抗Gas7多克隆抗体(1:100,Santa Cruz)室温下孵育切片过夜;生物素化兔抗羊Ig G(1:200,北京中山)室温下孵育1 h;SP(1:200,北京中山)室温下孵育1h。用抗体稀释液替代羊抗Gas7多克隆抗体进行阴性对照。

运用Image-Pro Plus Version 5.0彩色图像分析系统,以切片背景作背底校正,对每张切片 Gas7免疫反应产物进行光密度测定,并进行统计学分析。

3.W estern blot测定

2组大鼠中各取9只快速断头取大脑皮质,加入细胞裂解液(0.05mol/L Tris-HCl pH 7.4,0.05mol/L NaCl,1%Triton×-100,0.001mol/L EDTA pH8.0,0.01 mol/L PMSF,胃酶抑制剂 8μl,胰酶抑制剂200μl)匀浆,转移至离心管中,超声破碎;12000r/min 4℃离心20min,取上清;加上样缓冲液(2mol/L Tris-HCl p H6.8,20%SDS,0.25%甘油 ,10%β-巯基乙醇,0.5%溴酚蓝);取样品加到各个泳道,恒压(110v)电泳,12%SDS-PAGE分离蛋白样品,;将蛋白质转移到NC膜上,275mA恒流转膜,2h,室温下将NC膜用5%脱脂牛奶/0.01PBS封闭1h;用羊抗Gas7多克隆抗体(1:600)4℃过夜;5%脱脂牛奶/0.01mol/L PBS漂洗3次,每次10min;辣根过氧化物酶标记的兔抗羊Ig G(1:200)室温孵育2h;漂洗膜,用化学发光试剂(ECL plus Western Blitting Detection System,Amersham)在 X线胶片曝光后进行观察。将X光胶片置于疑胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)测定目标带光密度,与内参照光密度值相比后再行统计分析。

4.统 计学处理

数据均以均值±标准差(¯x±s)表示,用统计学软件SPSS-11.5进行 t检验,P<0.05为具有统计学意义。

结 果

1.G as7免疫组织化学结果

Gas7免疫阳性产物为棕黄色细小颗粒,主要表达在大鼠大脑皮质的神经元胞质和突起内,神经胶质细胞内无阳性表达。与对照组相比,低氧组阳性染色加深,图像分析结果显示:与正常对照组比较,低氧组平均光密度明显上升(P<0.05)(图1,表1)

图1 大鼠大脑皮质Gas7免疫反应性的分布。A:低氧组;B:正常对照组;SABC法×200Fig.1 Distribution of the Gas7 immunoreactivities in the cerebr al cortex.A:hypoxia group;B:rats in control group;SABC immunohistochemical staining,×200

表1 二组大鼠大脑皮质 Gas7表达水平的比较(¯x±S,n=9,OD 值)Table 1 Gas7 expression levels in the cerebral cortex of rats(¯x ±S,n=9,OD ratio)

2.W estern blot分析结果

Western blot检测表明,低氧组大鼠大脑皮质Gas7表达明显增强,与正常对照组相比,差异具有显著性(P<0.05)(图2,表2)。

图2 大鼠大脑皮质 Gas7蛋白水平 A:低氧组;B:对照组 ;(Gas7 38kDa;β-actin,42kDa)Fig.2 The levels of Gas7 protein in the cerebral cortex by Western blot..A:hypoxia group;B:the control group;(Gas7 38kDa andβ-actin 42kDa)

表2 二组大鼠皮质 Gas7的Western blot定量分析结果(¯x ±S)Table 2 Western blot analyses of Gas7 level in the cerebral cortex of rats(¯x ±S)

讨 论

生长休止基因家族是一种与细胞分化和活化相关的重要调节子[1],他们能够编码一些蛋白,其中生长休止特定蛋白7(Gas7)就是其中的一种,它最先是在1998年由台湾学者林淑端等[8]在去血清的NIH3T3细胞和 PC12中分离出来的,后来发现它广泛地分布于大脑皮质、海马、小脑,其它一些器官也有表达[9],目前的研究表明,在神经系统中,Gas7主要表达在神经元的核周质中,在神经胶质细胞中表达较少[4]。在人类成神经元瘤检测中发现 Gas7位于染色体17p11.3,或在等臂染色体17q的假定断裂点内[10]。Gas7在神经系统过度表达可导致神经突起异常增生[6],最近的研究认为,在某些条件下,Gas7可诱导胚胎干细胞[4]、PC12细胞或神经瘤细胞向成熟和终末方向发育和分化[5,6]。

研究模拟低氧环境对大鼠进行长达6周的饲养,观察低氧环境中大鼠大脑皮质 Gas7的表达变化,探讨Gas7的功能以及低氧环境对大脑皮质神经元的影响。我们的研究观察到,Gas7免疫阳性产物为棕黄色细小颗粒,表达在大鼠大脑皮质神经元的胞浆和突起内,神经胶质细胞内无阳性表达。与对照组相比,低氧组免疫反应性明显增强;Western blot结果显示,低氧组大鼠海马Gas7免疫反应阳性表达增强,提示 Gas7蛋白含量增多。

在高原低氧组大鼠大脑皮质中的 Gas7表达明显增强,说明 Gas7参与了低氧对大鼠大脑皮质神经元的影响;同时,早期的研究表明低氧可促进细胞凋亡和坏死,提示:在低氧状态下,Gas7可能与大脑皮质神经元的存活有关,参与了高原低氧对大鼠大脑皮质神经元结构和功能的影响。

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