清气化痰汤对急性肺损伤小鼠水通道蛋白1表达的影响*

邓青南 周建龙 郭振辉

广州军区广州总医院（广东广州510010）

内毒素性急性肺损伤（ALI）临床上表现为肺水肿及肺不张引起的呼吸急促，如果得不到及时有效的治疗，最终将会形成急性呼吸窘迫综合征，造成机体不可逆的急性呼吸功能衰竭。现代医学主要是采取大剂量激素冲击疗法配合细胞因子拮抗剂，中性粒细胞蛋白分解酶抑制剂，抗氧化剂等方法，疗效欠佳。中药治疗内毒素性肺损伤有其独特优势，目前主要为清热解毒、活血化瘀等方法［1-2］。自第一个水通道蛋白AQP1被发现以来，有关AQP的分布及其维持细胞内外稳态平衡中的作用日益受到重视。本实验通过脂多糖（LPS）复制ALI模型，探讨清气化痰汤和AQP1的相关性及清气化痰汤治疗ALI的机制。

1 材 料

健康昆明种小鼠24只，雄性，体质量18～20g，由广东省动物实验中心提供。脂多糖（LPS，美国Sigma公司）； AQP1、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、白细胞介素 1β（IL-1β）引物由上海生工提供。RNA提取及逆转录试剂盒（美国Promega公司）。清气化痰汤组成：瓜蒌仁 18g，杏仁 18g，枳实 18g，陈皮 18g，黄芩 18g，茯苓18g，制半夏27g，胆南星27g（由广州军区总医院药剂科提供，自行煎制）。

2 方 法

2.1 ALI动物模型制备 将24只小鼠随机平均分为空白对照组，模型对照组，清气化痰汤组。给小鼠腹腔注射质量浓度为200μg/mL的 LPS（10mg/kg）建立 ALI模型，对照组予以等量的生理盐水作为对照。在6h时间点处死小鼠，并立即解剖肺组织，左上肺进行湿重/干重比（w/d）检测，左中下行石蜡包埋，并制成病理切片。右肺制成肺组织匀浆行PCR检测。

2.2 w/d的测定与肺组织病理观察 称取左上肺湿重 （w）后，置70℃恒温箱，24h后称干重（d），计算w/d。肺组织经过10%的甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜下观察ALI的病理变化。

2.3 RT-PCR检测肺组织AQP1、TNF-α、IL-1β的mRNA表达。引物序列分别为：AQP1上游引物：CTGGCCTTTGGTTTGAGCGT，AQP1下游引物：CCACACACTGGGCGATGAT，片段长度为149bp；TNF-α 上游引物：AGCCGATGGGTTGTA，TNF-α 下游引物：ACTTGGGCAGATTGA，片段长度为266bp；IL-1β上游引物：GCTTCAGGCAGGCAGTAT，IL-1β 下游引物：ACAAACCGCTTTT CCATCT， 片段长度为 475bp；β-actin上游引物：CTGTCCCTGTATGCCTCTG，IL-1β 下游引物：ATGTCACGCACGATTTCC，片段长度为 218bp；AQP1的 PCR扩增条件：94℃变性 55s，53.5℃退火 56s，72℃延伸 55s，循环 35 次，72℃扩增 5min，TNF-α 的退火温度为53.5℃，其余条件相同。IL-1β的退火温度为53.5℃，其余条件相同。β-actin的退火温度为53.5℃，其余条件相同。长波紫外灯下观察并照相，Bio Rad成像系统分析电泳条带，Quantity One图像分析软件计算 AQP1、TNF-α、IL-1β 的 mRNA与 βactin mRNA比值。

2.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。数据以表示，组间差异的比较采用one-way ANOVA方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 肺大体观察 空白对照组、清气化痰汤组肺外观均无明显异常改变。模型对照组肺体积增大，暗红色，散在有大小不一红色斑点，切片疏松，有淡红色液体渗出。

3.2 肺病理观察 空白对照组、清气化痰汤组光镜下示肺泡结构清晰完整，无明显异常。模型对照组光镜下肺泡壁充血增厚，肺泡间隔增宽，腔内有少许出血、渗出及炎性细胞浸润，肺间质充血水肿，有大量炎性细胞浸润（见图1）。

图1 各组肺病理组织图（HE染色）

3.3 肺w/d 模型对照组的肺w/d值较空白对照组显著升高（P＜0.01），清气化痰汤组较模型对照组均明显改善（P＜0.05）（见表 1）。

3.4 AQP1mRNA、TNF-αmRNA和 IL-1βm RNA的表达 RTPCR检测结果显示：模型对照组大鼠肺组织AQP1 mRNA的表达较空白对照组明显降低 （P＜0.01），清气化痰汤组肺组织AQP1 mRNA的表达较模型对照组明显回升（P＜0.05）。模型对照组大鼠肺组织TNF-αmRNA的表达较对照组明显升高 （P＜0.05），清气化痰汤组肺组织TNF-αmRNA的表达较模型对照组明显降低（P＜0.05）（见表 2，图 2）。

表1 各组w/d比值的比较

表1 各组w/d比值的比较

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

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图2 PCR电泳结果

表 2 各组 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表达比较

表 2 各组 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表达比较

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4 讨 论

严重感染是最常见的原因，其中内毒素性ALI是临床上常见的危重病症，许多疾病都容易并发内毒素性ALI。其病理特征主要是肺组织水肿及肺不张，细胞上表现为多种炎性因子和炎症介质的过度释放，促炎抗炎反应失衡。近年研究表明，肺脏的液体平衡遭到破坏，通透性增高导致产生肺水肿与水通道蛋白密切相关。中医学认为感染、炎症等多属温热病范畴。肺为娇脏，为五脏之华盖，病邪入侵，常先伤肺，邪毒壅肺，肺失宣降，气不布津，又致病理产物内聚，机体炎症反应加重，病变由肺而累及全身，这与现代医学对于发生发展过程的认识甚为相似。中药或复方常常是多成分、多靶点、多途径、多机制发挥作用，对于综合调控复杂的炎症反应更具优势［3］。

AQPs是对水有特异性转运功能的细胞膜通道蛋白，人类和哺乳动物中发现有10个亚型，分布在肺、肾、眼部。其中已知在肺组织和气道至少有 4 种 AQPs （AQP1、AQP3、AQP4、AQP5）表达并参与肺液体转运，其中，与肺损伤关系最密切的研究主要以AQP5和AQP1为主。

AQP1主要在气道周围毛细血管、淋巴管及肺泡毛细血管内皮细胞和脏层胸膜间皮细胞上表达，主要负责清除支气管和脉管周围组织的内水分［4］。AQP5主要表达在肺泡Ⅰ型上皮细胞及气道分泌上皮顶质膜，作用主要是清除肺泡腔内水分［5］。AQP1、AQP5特异性地转运水分子，其他溶质和分子则不能通过，有效维持血管与间质之间水平衡［4］。与野生型小鼠相比，AQP1或AQP5基因敲除小鼠肺泡毛细血管间水的渗透性、通透性均降低约10倍。AQP1和AQP5均敲除小鼠肺泡毛细血管间水的渗透性、通透性降低约25～30倍左右［6-7］。AQPs在各种原因形成的肺损伤肺水肿中起重要作用。腺病毒感染小鼠毒造成病毒性肺炎，肺水明显增加，在病毒感染后7d和14d分别检测AQP1和AQP5，发现两者表达量均有显著降低，但在14天时AQP1的表达有所回升，同时与炎症反应减轻相一致，提示AQPs的减少可能是肺水在肺间质聚集的重要原因，表明AQPs可能在病毒感染后的肺水肿中起主要作用［8］。谭利平［9］研究发现，与空气对照组相比，高氧暴露不同时间后，AQP5特异性表达部位保持不变，但随暴露时间延长，AQP5表达呈逐渐减弱趋势，推测高氧肺损伤时AQP5表达降低，可能是高氧肺损伤肺水肿形成的原因之一。ALI/ARDS病理过程中，AQP1、5表达下调，肺泡-毛细血管间水转运障碍，导致液体在肺泡腔、肺间质的积聚，从而使肺泡腔、肺间质水肿加重，可能参与了肺水肿时液体的异常转运。研究发现肺损伤后AQP1、5在调节肺内液体平衡中起一定作用，可能参与了肺水肿的发病机制［10］。高巨［11］首次观察到失血性休克和内毒素刺激下大鼠肺组织AQP5的蛋白表达水平明显下调，肺组织损伤严重，提示二次打击后机体清除肺间质和肺泡腔过多水分的能力明显减弱，肺泡-毛细血管膜水通透性显著降低。与此相对应，二次打击后该组的肺组织含水量也明显增加。

本实验中，模型对照组大鼠w/d值较空白对照明显增大，出现肺间质水肿同时AQP1表达明显下调，经清气化痰汤治疗后，大鼠肺损伤肺水肿改善，同时AQP1表达上调。炎症因子TNF-α、IL-1β的表达与AQP1表达结果相反。实验证明肺水肿吸收障碍可能有与AQP1表达下调有关。清气化痰汤可通过增加肺毛细血管和淋巴管AQP1的表达，提高肺间质水肿液的跨内皮转运，促使水从肺间质回流到血管系统，进而促进肺水肿的吸收，可达到治疗ALI的目的。本研究发现清气化痰汤上调AQP1的表达，可能是通过下调TNF-α、IL-1β等表达实现的。

［1］ 韩恩昆，吴咸中.大承气汤和活血清胰汤对重型急性胰腺炎肺损伤治疗的实验研究［J］.中国中西医结合外科杂志，2004，10（2）：90-92.

［2］ 张雪梅，陈海龙，王朝晖.清胰汤对大鼠急性胰腺炎肺损伤时-表达的影响［J］.世界华人消化杂志，2007，15（35）：3738-3743.

［3］ 刘建新，余林中.中药保护急性肺损伤作用机理研究进展［J］.陕西中医学院学报，2009，11（6）：83-85.

［4］ SongYL，YangBX，Michael AM，etal.Roleofayuaporin water channels in pleural fluid dynamics［J］.Am JPhysioLCell Physiol，2000，279：1744-1750.

［5］ King LS，Agre P.Pathophysiology of theaquaporin water channels ［J］.Ann Rev Physiol，1997，58（5）：619-648.

［6］ Song Y，Ma T，Matthav M A，et al.Role of aquaporin-4 in airspaceto-capillary water permeability in intact mouse lung measured by a novel gravimetric method［J］.JGen Physiol，2000，115（1）：17-27

［7］ Ma T，Fukuda N，Song Y，et al.Lung fluid transport in aquaporin-5 knockout mice［J］.JClin Invest，2000，105（1）：93-100.

［8］ Towne J E，Harrod K S，Krane C M，et al.Decreased expression of aquaporin（AQP）1 and AQP5 in mouselungafter acuteviral infection［J］.Am JRespir Cell Mol Biol，2000，22（1）：34.

［9］ 谭利平.水通道蛋白5在高氧肺损伤中的表达及调节机制［J］.中国危重病急救医学，2006，18（8）：462-465.

［10］谢艳萍.急性肺损伤大鼠肺水通道蛋白1和5的表达及功能的实验研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2005，28（6）：385-400.

［11］高巨.“失血性休克-内毒素”二次打击所致肺损伤水通道蛋白的表达［J］.中国急救医学，2007，27（6）：546-548.