猪苓及猪苓多糖对膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬细胞吞噬和表面免疫相关分子表达的影响①

曾 星 李彩霞 黄 羽 张国伟 张 娴 杨 明 （广州中医药大学第二附属医院,广州 510006）

猪苓及猪苓多糖对膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬细胞吞噬和表面免疫相关分子表达的影响①

曾 星 李彩霞②黄 羽 张国伟 张 娴 杨 明 （广州中医药大学第二附属医院,广州 510006）

目的:观察猪苓及猪苓多糖（PPS）对BBN加糖精诱导的膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能、体外NO释放及共刺激分子和表面分子表达的影响。方法:实验分为空白对照组、模型组、PPS组和猪苓高中低剂量共6组。用流式细胞术检测膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞的荧光微球吞噬率、TLR4/CD14、CD86、CD40的表达。Griess试剂盒检测并分析猪苓及PPS对腹腔巨噬细胞体外NO释放的影响。结果:PPS组与模型组比较,PPS显著促进巨噬细胞吞噬率的增加、NO释放的比值均降低、巨噬细胞表面分子TLR4/CD14、CD86、CD40的表达均显著升高（P＜0.05）。不同浓度猪苓组与模型组比较巨噬细胞吞噬率增加、NO释放的比值均降低（P＜0.05）,巨噬细胞表面分子CD86表达增加。低浓度猪苓组巨噬细胞CD40表达百分率显著升高（P＜0.05）;但TLR4/CD14的表达无明显变化;中、高剂量猪苓组TLR4/CD14的表达百分率与模型组比较则降低（P＜0.05）,CD40的表达无统计学差异。结论:PPS可显著促进膀胱癌大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能和表面免疫相关分子的表达,但猪苓组对巨噬细胞功能的影响因剂量不同而表现出不同结果,可能与猪苓诸多成分同时作用或各成分作用的靶点不同有关。

猪苓;猪苓多糖;膀胱癌;腹腔巨噬细胞

膀胱癌是我国泌尿系统常见的肿瘤,也是治疗费用最为昂贵的肿瘤之一,探索治疗膀胱癌的有效价廉的方法已是临床需要解决的实际问题[1,2]。中医药在防治膀胱肿瘤方面,有其自身的特色,应用含猪苓复方及单味猪苓治膀胱癌已有临床应用报道[3],但作用机制不明,本研究以BBN诱导的膀胱癌模型大鼠腹腔巨噬细胞为研究对象探讨猪苓及其主要成分猪苓多糖的免疫调节作用,为中药的开发应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 雌性Fisher344大鼠,7周龄,购于北京维通利华实验动物有限公司;猪苓颗粒,购于江阴天江药业有限公司,每克相当于10克生药,用前按剂量溶于生理盐水;猪苓多糖,购于广东华南药业集团有限公司,用前按剂量溶于生理盐水;BBN购于日本TCI株式会社;糖精,购于上海第六制药厂;3μm的荧光微球,购于美国贝克曼库尔特公司;Griess试剂盒,购于美国 PROMEGA公司;CD14-FITC、CD86-FITC、CD40-PE购于美国eBioscience公司;TLR4-PE购于美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作及实验分组 实验用雌性F344大鼠60只,从实验开始到第8周给予含0.05%BBN的饮用水,第8周后加含5%糖精继续喂养至第20周止,从第9周开始给予猪苓及猪苓多糖干预,给予剂量为1ml/100 g至实验结束。实验分为6组即生理盐水组（Control）,模型组（BBN）,猪苓多糖（130mg/kg）组（PPS+BBN）,猪苓50 mg/kg组（L+ZL）,猪苓250mg/kg组（M+ZL）,猪苓500mg/kg组（H+ZL）,每组10只。

1.2.2 腹腔巨噬细胞的采集 采集腹腔巨噬细胞,接种于6孔细胞培养板中,37℃、5%CO2培养箱培养过夜。轻轻吸弃培养液后,再用 RPMI1640完全培养液洗去未贴壁细胞,贴壁细胞即为巨噬细胞。分别获取对照组及猪苓高中低剂量组各组存活动物的腹腔巨噬细胞用于流式细胞术检测。

1.2.3 流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能 将

1.2.2获取的腹腔巨噬细胞,加入直径为3μm成人血清包被的荧光微球,37℃水浴孵育2小时后,PBS洗,上机检测巨噬细胞吞噬荧光微球情况。

1.2.4 腹腔巨噬细胞体外NO释放 将1.2.2获取的腹腔巨噬细胞,调整细胞密度为5×108L-1。每孔200μl细胞悬液接种于96孔板,加入终质量浓度为10mg/L的LPS刺激24小时,收集培养巨噬细胞上清液,按Griess试剂说明书进行检测巨噬细胞NO分泌情况,用Ratio=LPS（+）/LPS（-）表示药物对巨噬细胞NO释放的影响。

1.2.5 流式细胞术检测腹腔巨噬细胞TLRs以及相关免疫分子的表达 将1.2.2获取的腹腔巨噬细胞转入试管中,用PBS洗细胞2次,调整细胞浓度为1×106ml-1,按照实验分组分别加入以下荧光标记抗 体:CD86-FITC、TLR4-PE/CD14-FITC、CD40-PE/CD14-FITC及CD11/18-FITC抗体。室温孵育20分钟,加300μl PBS重悬细胞后,同时设立相应的同型对照,上流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析 全部数据用SPSS11.0分析,n为样本数,数据用±s表示,组间数据比较用单因素方差分析,P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 膀胱癌模型制作和猪苓及猪苓多糖干预 膀胱癌诊断分类依据2004年WHO标准[4],实验中对照组存活10只大鼠,无一例成瘤;模型组存活9只,其中膀胱癌8只,不典型增生1只;猪苓多糖组存活7只,膀胱癌4 只;猪苓 50 mg/kg、250mg/kg、500 mg/kg三组存活大鼠分别为10只、9只和10只,其中膀胱癌分别为2只、3只和1只。

2.2 猪苓及猪苓多糖对腹腔巨噬细胞吞噬功能和体外NO释放的影响 模型组与空白对照组之间比较,巨噬细胞吞噬率明显降低（P＜0.05）。PPS组与模型组比较,显著促进巨噬细胞吞噬率的增加,具有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度猪苓组与模型组比较巨噬细胞吞噬率增加,有一定的浓度梯度依赖性,但无显著性差异,（结果见表1,图1）。模型组腹腔巨噬细胞NO释放的比值LPS（+）/LPS（-）与空白对照组比较明显升高（P＜0.05）,而PPS组与模型组比较则显著降低（P＜0.05）,不同浓度猪苓组与模型组比较NO释放的比值均显著降低（P＜0.05）,具有一定浓度梯度依赖,其中低浓度猪苓组降低尤为显著（结果见表1,图2）。

2.3 猪苓和猪苓多糖对腹腔巨噬细胞TLR4/CD14、CD86、CD40表达的影响 模型组与空白对照组之间比较,腹腔巨噬细胞TLR4/CD14的表达升高,但无显著性差异（P＞0.05）。共刺激分子CD86、CD40均显著降低（P＜0.05）。PPS组与模型组比较,腹腔巨噬细胞TLR4/CD14的表达显著升高（P＜0.05）。低剂量猪苓组TLR4/CD14的表达百分率与模型组无显著性差异（P＞0.05）。中、高剂量猪苓组TLR4/CD14的表达百分率与模型组比较则显著降低（P＜0.05,结果见表1、图3）。PPS组及不同浓度的猪苓组与模型组比较,巨噬细胞表面共刺激分子CD86均显著升高（P＜0.05,结果见表1、图4）,其中以PPS组尤其显著,猪苓组CD86的表达百分率有一定梯度依赖。PPS组与低浓度猪苓组巨噬细胞CD40表达百分率显著升高（P＜0.05）;而猪苓组中剂量和高剂量组CD40的表达百分率与模型组比较无统计学差异（结果见表1,图5）。

表1 猪苓及猪苓多糖对腹腔巨噬细胞吞噬率、NO释放及其表面分子表达的影响Tab.1 Influence of Polyporus umbellatus and PPSon the phagocytosis,NO production ofperitonealmacrophage in vitro and theexp ression of surfacemarkers of peritonealmacrophages

图2 猪苓及猪苓多糖对腹腔巨噬细胞体外NO释放的影响Fig.2 Influence of Polyporus umbellatus and PPS on NO production of peritonealmacrophage in vitro

图3 腹腔巨噬细胞TLR4/CD14的表达Fig.3 The expression of TLR4/CD14 on peritonealmacrophage

图4 腹腔巨噬细胞CD86的表达Fig.4 The expression of CD86 on peritonealmacrophage

图5 腹腔巨噬细胞CD40/CD14的表达Fig.5 The expression of CD40/CD14 on peritonealmacrophage

3 讨论

巨噬细胞是免疫系统中一类具有防御和调节功能的细胞,这类细胞也可通过呈递抗原和分泌各种细胞因子来进行免疫调节,在抗肿瘤免疫方面起着重要的作用。多糖作为一种免疫调节剂,能刺激机体的各种免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖,多糖抗肿瘤的机制也被认为与巨噬细胞参与的机体免疫功能提高有关。研究表明,枸杞多糖可上调腹腔巨噬细胞CD40、CD80和CD86[5]。马齿苋多糖能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞功能,增加小鼠巨噬细胞数量[6]。本动物实验结果显示,实验中对照组存活9只大鼠,无一例成瘤,而模型组存活9只,病理诊断膀胱癌8只,不典型增生1只,BBN诱导大鼠膀胱癌动物模型制作成功。猪苓多糖组存活7只,膀胱癌4只 ;猪苓 50mg/kg 组 、250mg/kg 组 、500mg/kg 三组存活大鼠分别为10只、9只和10只,其中诊断膀胱癌分别为2只、3只和1只。猪苓多糖及猪苓对BBN诱导大鼠膀胱癌具有一定的预防作用,其作用机制与猪苓多糖及猪苓提高机体的免疫功能具有一定的关系。但是猪苓多糖组成活动物数较猪苓组减少2～3只,可能与研究中观察到的猪苓多糖组大鼠体重较猪苓组下降以及只有猪苓多糖组血肌酐清除率明显增加有关,差异显著性有统计学意义。其原因可能是猪苓多糖本身对实验大鼠具有一定的肾毒性作用或所用猪苓多糖为市场购买品种,与药品批次质量有关。而猪苓由许多成分组成,各组成成分之间具有协同或拮抗作用,也是应用复方中药副作用少的原因之一。本研究取各实验组动物腹腔巨噬细胞,观察其吞噬和免疫功能。结果表明,PPS组模型组比较,显著促进巨噬细胞吞噬率的增加。不同浓度猪苓之间比较有一定的浓度梯度依赖性,与模型组比较巨噬细胞吞噬率增加。脂多糖（LPS）是巨噬细胞（Mφ）激活释放大量一氧化氮（NO）及TNF-α的强激活剂,当然巨噬细胞过度激活损伤组织细胞也是主要的致病分子。本研究结果显示,模型组腹腔巨噬细胞NO释放的比值LPS（+）/LPS（-）与空白对照组比较明显升高（P＜0.05）,而PPS组与模型组比较则显著降低（P＜0.05）,不同浓度猪苓组与模型组比较NO释放的比值均显著降低（P＜0.05）,其中低浓度猪苓组降低尤为显著。说明猪苓及猪苓多糖对LPS诱导的腹腔巨噬细胞NO的释放具有抑制作用,提示猪苓及猪苓多糖对在体外加入LPS后过度激活巨噬细胞时或LPS介导的细胞毒作用,PPS具有免疫抑制或细胞保护作用。而本实验结果显示,PPS能显著提高腹腔巨噬细胞TLR4/CD14的表达,阳性细胞百分比达到53.35±12.34,但是猪苓组无明显上调TLR4/CD14的表达,与猪苓中除猪苓多糖之外的组成成分抑制或调节有关,也说明猪苓多糖是通过TLR4激活腹腔巨噬细胞,促进其发挥吞噬和免疫调节功能。

中药多糖对T细胞的活化、增殖、分化、细胞因子的分泌等不同环节显示不同的促进作用。在参与T细胞激活的诸多协同刺激分子中,最重要的是T细胞表面CD28分子与APC表面相应配体CD80和CD86的结合[7]。本研究表明,模型组与空白对照组之间比较,腹腔巨噬细胞表面共刺激分子CD86显著降低（P＜0.05）。PPS组及不同浓度的猪苓组与模型组比较,巨噬细胞表面共刺激分子CD86显著升高（P＜0.05）,其中以PPS组尤其显著,猪苓组CD86的表达百分率有一定梯度依赖,表明猪苓及猪苓多糖都可通过增加腹腔巨噬细胞共刺激分子CD86的表达,为T淋巴细胞活化提供第二信号,有利于活化T淋巴细胞,从而增强机体的免疫应答。CD40与其配体CD40L也是免疫细胞间重要的信号传导通路[8],研究认为[3],CD40/CD40L主要是通过促进巨噬细胞等APC细胞表达CD80和CD86等共刺激分子来发挥其作用的。首先,当APC细胞接受外来抗原,并经过加工将其提呈给天然T淋巴细胞时,T细胞活化并表达CD40L。高表达的CD40L与APC细胞表面的CD40结合促进APC细胞表达CD80、CD86等共刺激分子及粘附分子的表达,这些分子再与T细胞表面的配体CD28、CTLA-4结合,形成对T细胞刺激的第二信号,从而使T细胞进一步活化,放大免疫应答。本实验中结果表明,PPS可诱导腹腔巨噬细胞CD40的表达,促进巨噬细胞表达CD86共刺激分子的表达,从而扩大免疫应答。低剂量猪苓组可刺激巨噬细胞CD40的表达,同PPS组结果平行,而猪苓中剂量和高剂量组则不能有效诱导巨噬细胞CD40的表达,可能与猪苓中的复杂成分的抑制作用有关,猪苓组成成分的免疫调节机制还有待进一步深入研究。

1 吴阶平.吴阶平泌尿外科学[M].济南:山东科学技术出版社,2004:965-980.

2 Pectasides D,PectasidesM,Nikolaou Metal.Adjuvant and neoadjuvant chemotherapy inmuscle invasive bladder cancer:literature review[J].Eur Urol,2005;48（1）:60-67.

3 丁向东,张沁园.全身热疗结合猪苓汤加味治疗中晚期膀胱癌42例[J].中国中西医结合杂志,2007;27（2）:167-168.

4 Lopez-Beltran A,Cheng L,Comperat Eetal.Large cell undifferentiated carcinome of the urinary bladder[J].Pathology,2010;42（4）:364-368.

5 Chen Z,Soo M Y,Srinivasan Netal.Activation of macrophages by polysaccharide-protein complex from Lycium barbarum L[J].Phytother Res,2009;23（8）:1116-1122.

6 卢新华,何军山,朱湘忠.马齿苋多糖对小鼠免疫功能影响的研究[J].中药药理与临床,2006;22（3-4）:89-90.

7 Shim H K,Kim JY,Kim M Jetal.Legionella lipoprotein activates tolllike receptor 2 and induces cytokineproduction and expression of costimulatorymolecules in peritonealmacrophages[J].Exp Mol Med,2009;41（10）:687-694.

8 Feder-Mengus C,Schultz-Thater E,Oertli Detal.Nonreplicating recombinant vaccinia virus expressing CD40 ligand enhances APC capacity to stimulate specific CD4+andCD8+Tcell responses[J].Hum Gene Ther,2005;16（3）:348-360.

[收稿2011-01-24 修回2011-02-14]

（编辑 倪 鹏）

Effectsof Polyporus umbellatus and Polyporus Polysaccharide on the phagocytosis function and costimulatory molecules expression of peritoneal macrophages in rat bladder cancer

ZENGXing,LICai-Xia,HUANGYu,ZHANGGuo-Wei,ZHANGXian,YANGMing.TheSecondAffiliatedHospital,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China

Objective:To observe the effects of Polyporus umbellatus and Polyporus polysaccharide（PPS）on the phagocytic function,NO release,and costimu latorymoleculesexpression of peritonealmacrophagesin BBN-induced ratbladder cancer.Methods:Six groupsincluding blank control group,modelgroup,PPSgroup,high-dose Polyporus group,m iddle-dose Polyporus group and low-dose Polyporus group were set up in this study.The phagocytosis and theexpression of surfacemarkerswere detected by flow cytometer（FCM）.Nitric oxide（NO）production in peritonealmacrophages supernatantswas determ ined by usingGriess reagent.Results:Phagocytosisofmacrophages,and the percentages of TLR4/CD14,CD86,CD40 in peritonealmacrophages of PPSgroupwas significantly higher than those ofmodel group,while NO releasewas lower（P＜0.05）.Compared tomodelgroup,Phagocytosis ofmacrophages and the percentages ofCD86 in peritonealmacrophagesof thegroups treatedwith different dose of Polyporus significantly increased,while NO release significantly decreased（P＜0.05）.After treatmentwith lowdose Polyporus,CD40 exp ression of macrophages increased,while TLR4/CD14 expression had no change.TLR4/CD14 expression of macrophages decreased after being treated withmiddle-dose Polyporus or high-dose Polyporus,while CD40 expression had no had no change.Conclusion:PPS can promote phagocytic function,expression of costimu latorymolecules of peritonealmacrophages in BBN-induced bladder cancer rats.Polyporus has differentoreven contracteffects on function ofmacrophageswhen using of different dosage,and these effectsmay be the consequences of complex components of Polyporusacting on different targets.

Polyporus umbellatus;Polyporus polysaccharide（PPS）;Bladder cancer;Peritonealmacrophages

R285.5

A

1000-484X（2011）05-0414-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.007

①本文为国家自然科学基金项目（30873426）、教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（200805720010）和广东省科技计划（2010B030700059）

②同时供职于广州中医药大学基础医学院,广州510006

曾 星（1959年-）,女,研究员,博士生导师,主要从事中药药理研究,E-mail:zengxing-china@163.com。