辛伐他汀对细菌脂多糖共孵育内皮祖细胞功能的影响

邢金燕，徐敏，陈玉国，王素华，苑志勇

（1.山东大学齐鲁医院急诊科，济南 250012；2.胜利油田中心医院重症医学科，山东 东营 257000；3.青岛大学医学院附属医院重症医学科，山东 青岛 266003）

辛伐他汀对细菌脂多糖共孵育内皮祖细胞功能的影响

邢金燕1，徐敏2，陈玉国1，王素华3，苑志勇3

（1.山东大学齐鲁医院急诊科，济南 250012；2.胜利油田中心医院重症医学科，山东 东营 257000；3.青岛大学医学院附属医院重症医学科，山东 青岛 266003）

目的观察不同浓度辛伐他汀对与细菌脂多糖（LPS）共孵育人内皮祖细胞（EPCs）增殖、迁移、黏附功能的影响。方法 采用密度梯度离心法从成人外周静脉血获取单个核细胞，将其接种在人纤维连接蛋白包被培养板上，培养7d，收集贴壁细胞，通过激光共聚焦显微镜鉴定为正在分化的EPCs。EPCs传代培养3d，消化搜集贴壁细胞，调节细胞浓度至105/ml，将等量EPCs接种到96孔培养板上，随机分为5组：（1）空白对照组，EGM-2MV标准液培养48h。（2）LPS孵育组，GM-2MV标准液与LPS液（100ng/mL）共同培养48h。（3）辛伐他汀干预组：GM-2MV标准液与LPS液培养24h，细胞换液，后分别加入0.1μmol/L（simv 0.1组）、1.0μmol/L（simv 1.0组）、10.0μmol/L（simv 10.0组）不同浓度辛伐他汀液培养 24h。应用 MTT 比色法、改良的Boyden小室观察其增殖、迁移、黏附功能。结果 人EPCs与LPS共孵育后其增殖显著降低（P=0.009），黏附、迁移能力有降低，但差异无统计学意义（P=0.279，P=0.056）。加入不同浓度辛伐他汀后EPCs的增殖、迁移和黏附能力不同程度改善，随辛伐他汀浓度增加，该作用增强，辛伐他汀浓度为0.1μmol/L增殖、黏附、迁移功能较LPS组均改善，但无统计学差异（P分别为0.687、0.501、0.683）、浓度为 1.0μmol/L 时，EPCs增殖显著改善（P=0.017），浓度 10.0μmol/L 时 EPCs增殖、黏附、迁移功能，较 LPS 组均显著改善（P分别为0.00，0.002，0.00），其中黏附和迁移功能较对照显著改善（P=0.039，P=0.000）。结论LPS可使EPCs增殖功能显著降低，黏附和迁移能力有所下降。辛伐他汀可以改善LPS导致的EPCs增殖、黏附、迁移功能的降低，在研究范围内改善作用随浓度增加而增强。

他汀；内皮祖细胞；增殖；迁移；黏附

脓毒症（sepsis）是继发于感染的全身炎性反应综合征，目前研究认为内皮细胞功能和结构异常在脓毒症的病情进展中起重要作用［1］。1997年，Asahara等［2］首次证明循环外周血中存在具有在体内外增殖、迁徙和分化为成熟血管内皮细胞的能力的前体细胞，并将其命名为内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）。EPC可以在体内分化为内皮细胞（endothelium cells，ECs），是参与出生后生理性及病理性血管形成最主要的细胞。脓毒症患者循环EPCs数量与病情严重程度及预后相关。辛伐他汀能增加EPCs的增殖、迁移、抗凋亡能力［3］。有多项研究发现他汀类药物在脓毒症的发生及进展中起重要作用［4，5］，但他汀类药物对脂多糖（LPS） 作用后EPCs的影响未见报道。本课题通过LPS与人EPCs共孵育后，加入不同浓度辛伐他汀，在细胞水平观察辛伐他汀及LPS对EPCs增殖、迁移、黏附功能的影响，探讨他汀类药物对LPS孵育后内皮祖细胞的作用，为临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 EPCs提取

实验血液样本来自健康志愿者，密度梯度离心法获取单个核细胞，将单个核细胞铺在包被有人纤维连接蛋白（Roche公司，德国）的培养板上。应用EGM-2MV（LONZA公司，瑞士）培养4d，用PBS洗除非贴壁细胞，继续培养至7d，再加PBS洗除非贴壁细胞，取贴壁细胞供实验用。

1.2 EPCs鉴定

细胞与 DiI-acLDL（2.4μg/ml）（Biomedical公司，美国）37℃下孵育1h以检测EPCs对DiI-acLDL的摄取。然后用2%多聚甲醛固定细胞10min，固定后用 PBS 浸洗，将 FITC-UEA-I（10μg/ml）（Vector公司，美国）加于上述标本37℃下孵育1h。在激光共聚焦显微镜下（LSCM，Zeiss公司，德国）UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。

1.3 实验分组

贴壁细胞随机分为5组：（1）空白对照组，EGM-2MV 标准液培养 48h；（2）LPS孵育组，GM-2MV 标准液与 LPS 液（100ng/mL）共同培养 48h；（3）辛伐他汀干预组，根据辛伐他汀浓度不同分为3个组：GM-2MV标准液与LPS液培养24h，细胞换液后分别加入 0.1μmol/L（simv 0.1组）、1.0μmol/L（simv 1.0组）、10.0μmol/L（simv 10.0组）3种不同浓度辛伐他汀液培养24h。

1.4 增殖功能检测

EPCs传代培养3d后，用0.25%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，1500r/min离心4min，弃上清，悬浮于EGM-2MV标准液，吹打混匀，计数，调节细胞浓度至105/ml。将等量EPCs接种到96孔培养板上，设每列为1组，共5组，每组设6个复孔（每孔加100μl），培养24h。弃上清，再加入EGM-2MV饥饿液，培养24h，使细胞周期同步化。弃上清，分别按上述分组方案向每组加入相应试剂。48h后加入MTT液10μl，37℃培养箱内孵育 4h，弃上清，向每孔加入DMSO（二甲基亚砜液）150μl，于微量振荡器充分振荡10min，置酶标仪于波长490nm处测OD值。

1.5 迁移功能检测

EPCs传代培养3d后，用0.25%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，1500r/min离心4min，弃上液，用前述EGM-2MV标准液吹打混匀，计数，调节细胞浓度至106/ml。每下室按前述分组加入600μl相应试剂，共5组，每组设6个复孔，上室与下室之间隔以8.0μm孔径硝酸纤维膜。将等量EPCs接种到Transwell小室上室，每上室加入100μl，共30孔。48h后，用无菌棉棒擦去上室滤膜上面的未移动细胞。加入MTT液60μl至下室，37℃培养箱内孵育4h，吸弃下室上清液，向每孔加入DMSO液700μl，于微量振荡器充分振荡10min，置酶标仪于波长490nm处测OD值。

1.6 黏附功能检测

EPCs传代培养3d后，用0.25%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，1500r/min离心机离心4min，弃上液，用前述EGM-2MV标准液吹打混匀，计数，调节细胞浓度至105/ml。将等量EPCs接种到12孔培养板中，共5孔（每孔加1ml），培养24h。弃上清，再加入EGM-2MV饥饿液，培养24h，使细胞周期同步化。弃上清，分别按上述分组方案向每孔加入相应实验试剂。48h后，用0．25%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞，分别悬浮在600μl EGM-2MV标准液中，计数。然后将同等数目的EPCs接种在96孔板内，每组设6个复孔，在37℃下培养30min。吸弃上清液，加入 MTT 液 10μl，EGM-2MV 标准液 90μl，37℃培养箱内孵育4h，吸弃上清液，向每孔加入DMSO液150μl，于微量振荡器充分振荡10min，置酶标仪于波长490nm处测OD值。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 EPCs鉴定

在培养过程中倒置显微镜下观察EPCs的形态特点，见细胞成短梭状，成簇排列，增殖良好。用DiI-acLDL和FITC-UEA-I染色后，激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）观察荧光表达情况，UEA-I和DiI-acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs，随机选取6个视野，分别计算两种培养基培养的贴壁细胞中双染阳性细胞的百分率，均在96%左右。

2.2 辛伐他汀与LPS对EPCs增殖的影响

仅使用EGM-2MV标准液培养48h，EPCs增殖的OD值为0.13533±0.01353，EPC与LPS共孵育，EPCs增殖的OD值为0.11833±0.01286，其增殖能力显著降低（P=0.009），加入辛伐他汀后其增殖OD值较与LPS共同孵育后均有提高，辛伐他汀浓度1.0μmol/L时EPCs增殖功能较LPS组显著提高（P=0.017）。10.0μmol/L 的辛伐他汀作用后，EPCs增殖能力较LPS组显著改善（P=0.000），较空白对照组有改善，但无统计学差异（P=0.241），见表1。

2.3 辛伐他汀与LPS对EPCs迁移的影响

仅使用EGM-2MV标准液培养的对照组，EPCs迁移的OD值为0.0885±0.0120，LPS作用后EPCs迁移OD值降低（P=0.026），应用不同浓度辛伐他汀共孵育后，EPCs迁移水平逐渐改善，0.1μmol/L时对照组无差异（P=0.683），加用 1.0μmol/L 辛伐他汀后EPCs迁移功能较LPS组改善，但无统计学意义（P=0.069），10.0μmol/L 辛伐他汀作用后，EPCs迁移能力较对照组和LPS组均显著改善作用（P=0.000，P=0.000），见表 1。

2.4 辛伐他汀与LPS对EPCs黏附的影响

与使用EGM-2MV标准液培养的对照组比较，EPCs黏附OD值在LPS作用后有降低，但差异无统计学意义（P=0.279），与辛伐他汀作用后，呈现浓度依赖性变化，0.1μmol/L、1.0μmol/L 辛伐他汀作用后EPCs黏附能力与LPS组比较有改善，但无统计学意义（P=0.505，P=0.064），10.0μmol/L 辛伐他汀作用后与LPS共孵育的EPCs黏附能力显著改善（P=0.002），与对照组比较EPCs的黏附能力也有显著改善（P=0.039），见表 1。

表1L P S和不同浓度辛伐他汀作用下E P C s的增殖、迁移、黏附O D值（490n m）T a b.1T h eO p t i c a l d e n s i t yo f p r o l i f e r a t i o n，mi g r a t i o na n da d h e s i o no f E P C si n c u b a t e dw i t hL P Sa n d/o r s i mv a s t a t i ni n d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n（490n m）Group Proliferation Migration Adhesion Control 0.1353±0.0135 0.0885±0.0120 0.0753±0.0070LPS 0.1183±0.01292） 0.0868±0.00671） 0.0697±0.0097Simv0.1 0.1208±0.00731） 0.0892±0.0091 0.0732±0.0133Simv1.0 0.1337±0.01643） 0.0943±0.0177 0.0800±0.0165Simv10.0 0.1427±0.01884） 0.0982±0.00612），4） 0.0863±0.02011），4）1）P<0.05vs control group；2）P<0.01vs control group；3）P<0.05vs LPS group；4）P<0.01vs LPS group.

3 讨论

内皮细胞损伤在脓毒症病情进展中起重要作用，并与预后相关［6］。Chape1等［7］在2003年首次证实多能干细胞可以在机体发生MODS后向不同组织迁徙或归巢，发挥组织修复作用。内皮祖细胞在脓毒症患者内皮细胞损伤修复和维持内皮完整性中起重要作用，并可能成为脓毒症诊断和治疗策略中的重要部分［8］。Rafat等［9］对危重病患者的外周血循环EPCs测定发现，感染患者EPCs数量较非感染患者及健康者均显著升高，而死亡脓毒症患者的循环EPCs水平显著降低。Mayr等［10］对健康志愿者注射LPS，发现其循环EPCs显著降低，在6h左右最低，同时测定TNF、VEGF和G-CSF水平，发现相互间有明确相关性，推测LPS对EPCs的作用与细胞因子作用有关。

2000年Ando等［11］首先报道事先采用他汀类药物干预可以改善大鼠脓毒症的生存率，后有大量研究证实他汀类药物确实可以降低脓毒症的患病率和发病率，但对其作用机制研究大多集中于炎性因子及其途径，包括对于NO、凋亡路径等影响［12］。近期研究证实循环EPCs水平与脓毒症患者预后相关，足量的EPCs对感染损伤后组织的修复是必要的［13］。有研究通过失血性休克、复苏、注入内毒素制造猪MODS模型，发现失血性休克猪的EPC升高，在脓毒症早期达峰值，发生MODS后持续降低，并持续至死亡，存活者的EPCs后期出现升高［14］。Rafat等［9］对脓毒症患者EPCs测定，发现脓毒症患者EPCs显著升高，并且存活者较死亡者EPCs数量更高，提出循环EPCs数量可以作为脓毒症患者预后指标。对于单纯肺损伤患者也得出的相似结论，对ALI患者研究发现EPC高的患者有更高的28d生存率，伴脓毒症患者近半数EPC升高［15］。近年来研究显示他汀类药物可以改善EPCs的增殖、迁移、抗凋亡功能［3］。但对于他汀类药物对LPS作用后EPCs的影响未见相关报道。本实验将EPCs与LPS共孵育后，加入不同剂量的辛伐他汀共孵育，显示辛伐他汀可使与LPS共孵育的EPCs的降低的增殖、迁移、黏附能力改善，该作用随辛伐他汀剂量增加而增强，10.0μmol/L的辛伐他汀作用后与LPS共孵育EPCs迁移和黏附功能较仅使用EGM-2MV标准液培养EPCs组改善，增殖功能也有改善，但无统计学意义；表明10.0μmol/L的辛伐他汀不仅抵消LPS对EPCs增殖、迁移和黏附能力的影响，甚至可以使其改善，具体机制有待于进一步研究。

本实验证实，单纯LPS可导致EPCs增殖能力显著降低，迁移和黏附能力下降；加入不同浓度辛伐他汀可不同程度逆转该影响，0.1μmol/L的辛伐他汀作用后与LPS共孵育EPCs增殖、迁移和黏附功能基本达到单纯EPCs孵育水平；10.0μmol/L的辛伐他汀作用后LPS孵育后EPCs的迁移、黏附与仅使用EGM-2MV标准液培养EPCs组比较均显著改善，增殖能力也有提高，对于其具体的作用通路有待于进一步研究。

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（编辑裘孝琦，英文编辑王又冬）

Effects of Simvastatin on the Functions of Endothelial Progenitor Cells Incubated with Lipopolysaccharide

XING Jin-yan1，XU Min2，CHEN Yu-guo1，WANG Su-hua3，YUAN Zhi-yong3
（1.Department of Emergency，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China；2.Department of Intensive Care Unit，The Central Hospital of Shengli Oil Field，Dongying 257000，China；3.Department of Intensive Care Unit，The Affiliated Hospital，College of Medicine，Qingdao University，Qingdao 266003，China）

ObjectiveTo investigate the effect of simvastatin at different concentration on the functions of endothelial progenitor cells（EPCs） incubated with lipopolysaccharide（LPS） in vitro.MethodsTotal mononuclear cells（MNCs） were isolated from human peripheral blood by Ficoll density gradient centrifugation，and then the cells were plated on fibronectin-coated culture dishes.After 7days culture，attached cells were isolated and assessed with a laser scanning confocal microscope.EPCs were cultivated with standard EGM-2MW fluid（control group）or plus LPS（100ng/ml）（LPS group）or first incubated with LPS for 24hours and then added simvastatin of different concentrations （0.1μmol/L，1.0μmol/L and 10.0μmol/L）.The proliferation，adhesion and migration of EPCs were detected with MTT assay，modified Boyden chamber assay after 48hours respectively.And the influences of LPS and simvastatin on EPCs′proliferation，adhesion and migration were evaluated.ResultsIncubated with LPS，the proliferation of EPCs were declined significantly （P=0.009），the adhesion and migration of EPCs were also descended，but there was no significance（P=0.279，P=0.056）.With the addition of simvastatin，the proliferation，adhesion and migration of EPCs were all improved.There was hardly any improvment in the proliferation，adhesion and migration of EPCs when added of 0.1μmol/L simvastatin （P=0.687，P=0.501，P=0.683，respectively），EPCs′proliferation was improved significantly when incubated with simvastatin of 1.0μmol/L compared with LPS group（P=0.017），while the adhesion and migration were also improved but there was no significance（P=0.064，P=0.069respectively）.When incubated with simvastatin at the concentration of 10.0μmol/L the proliferation 、adhesion and migration of EPCs were all improved significantly（P=0.00，P=0.002，P=0.00respectively）compared with LPS group，and the adhesion and migration of EPCs were ameliorated significantly even compared with the EPCs cultivated with standard EGM-2MW fluid（P=0.039，P=0.000respectivly）.ConclusionLPS could cut down the proliferation of EPCs sharply，while the adhesion and migration were declined when incubated with EPCs.Simvastatin could improve the declined proliferation，adhesion and migration of EPCs which incubated with LPS first.

statins；endothelial progenitor cells；proliferation；migration；adhesion

R962

A

0258-4646（2011）02-0153-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0953.014

山东省“医学领军人才”项目，山东省"1020工程"杰出学科带头人项目

邢金燕（1971-），女，副主任医师，硕士.现在青岛大学医学院附属医院工作.

陈玉国，E-mail：chen919085@126.com

2010-10-22