紫外线诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤与小窝蛋白1mRNA表达量下降有关

2011-02-03赵芳坤赵江月李嶔于佳明刘秋芳赵恂张劲松

中国医科大学学报 2011年2期

赵芳坤，赵江月，李嶔，于佳明，刘秋芳，赵恂，张劲松

（1.中国医科大学附属第四医院眼科，沈阳 110005； 2.中国医科大学附属第四医院中心实验室，沈阳 110032；3.中国医科大学毒理学教研室，沈阳 110001；4.中国医科大学实验技术中心二部，沈阳 110001）

赵芳坤1，赵江月1，李嶔2，于佳明1，刘秋芳3，赵恂4，张劲松1

目的紫外线（UV）照射导致的氧化损伤是晶状体上皮细胞凋亡的原因之一，而小窝蛋白（Caveolin）参与晶状体上皮细胞凋亡过程。本实验拟研究紫外线造成的氧化损伤中Caveolin-1表达变化与晶体上皮细胞凋亡之间的关系，同时探讨阿司匹林（ASA）作为抗氧化剂对Caveolin-1表达及晶状体上皮细胞凋亡的影响。方法 UVB（4.43mw/cm2）照射人晶状体上皮细胞系SRA01/04（0s，5s，10s，20s），按照是否加入阿司匹林分为实验组和对照组。分别检测实验组和对照组细胞活性；利用AnnexinV-EGFP法检测细胞凋亡率；real time RT-PCR方法定量分析Caveolin-1mRNA的量随照射剂量不同，及加入抗氧化剂前后所产生的变化。结果随UV照射时间延长，单纯紫外线照射组细胞活性，Caveolin-1mRNA表达量下降，细胞凋亡率增加。加入阿司匹林后，细胞活性增加。5s，10s组Caveolin-1mRNA的表达量较对照组升高，细胞凋亡率较对照组下降（P<0.05）。但是照射20s的条件下，加药后的细胞凋亡率及Caveolin-1mRNA的表达量较未加药组无变化（P>0.05）。结论UV照射可造成人晶状体上皮细胞凋亡，Caveolin-1mRNA表达量减少，推测Caveolin-1表达量的变化可能与凋亡有关。低剂量的阿司匹林（3μmol/L）可以在一定程度上减少UV照射造成的晶状体上皮细胞凋亡，增加Caveolin-1的表达；但大剂量阿司匹林（>30μmol/L）会起到相反的作用，因此找到一个合适安全的剂量范围具有一定临床意义。

紫外线；小窝蛋白1；凋亡；阿司匹林；晶状体上皮细胞

白内障（cataract）是目前世界首位的致盲眼病。长期慢性的紫外线（UV）辐射最先损害的靶组织是晶状体上皮细胞（lens epithelial cells，LECs）。研究发现人和动物眼部多种类型的细胞膜上存在特殊的微区-小窝（caveolae）。小窝蛋白（Caveolin）是其主要的结构蛋白，在修复角膜上皮调控晶状体上皮细胞及皮质纤维细胞质膜上的胆固醇分布，细胞膜物质转运［1］，细胞间通讯［2］，特别是在晶状体上皮细胞遭受氧化应激时，保护细胞免遭氧化损伤等方面发挥关键作用。Li等［3］研究认为，晶体上皮细胞凋亡是除先天性白内障以外的所有类型白内障形成的细胞学基础，而氧化损伤则是晶体上皮细胞凋亡的重要诱发因素。阿司匹林作为一种常用的解热镇痛抗炎药，研究发现其具有抗氧化损伤和抑制蛋白质水解的作用。

本研究通过UV照射人LECs造成氧化损伤模型，探讨不同剂量UV照射造成的晶体上皮细胞凋亡及小窝蛋白1mRNA表达量之间的关系，以及阿司匹林的抗氧化损伤作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞来源：人晶状体上皮细胞系SRA01/04（中国医科大学附属第四医院眼科提供）。

1.1.2 主要试剂和仪器：DMEM培养液、胎牛血清（Hyclone公司），双抗（青霉素、链霉素）Trizol（Invitrogen），Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time（Takara SYBR Green Assay），Real time PCR 试剂盒（Takara SYBR Premix Ex Taq），Annexin V-EGFP 凋亡检测试剂盒（KeyGen Annexin V-EGFP Apoptosis Detection Kit，MTT（碧云天细胞活性检测试剂盒），阿司匹林、DMSO（美国Sigma公司）。紫外灯（美国spectronics corporation），酶标仪（北京普朗公司），紫外分光光度计（日本SHIMADZU），Real time PCR仪（ABI 7500system），流式细胞仪（BD FACSCalibur）

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：人晶状体上皮细胞系SRA01/04加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于5%的CO2孵箱，37℃培养。用紫外线照射细胞，并按是否加入抗氧化剂分为实验组和对照组。

1.2.2 抗氧化剂阿司匹林的配制：用DMSO配制阿司匹林储存液（0.3mol/L），用无血清培养基梯度稀释为（30，3mmol/L，300，30，3μmol/L）。

1.2.3 紫外线照射方法：紫外灯光谱范围为250～365nm，取对数生长期的细胞置于紫外光源下10cm 处，强度为 4.43mw/cm2，照射时间为 0、5、10、20s，相应的照射剂量约为 0、20、40、80mJ/cm2。照射前将培养液吸净，用PBS冲洗1次，照射时打开培养皿盖。对照组照射后换无血清培养液；实验组照射前用阿司匹林孵育2h，照射后换含有阿司匹林的培养液。继续培养24h，收集细胞。

1.2.4 MTT法检测细胞活性：将细胞以1×105/ml的密度接种于96孔板中，培养24h至单层细胞铺满孔底。按上述方法制造氧化损伤模型后，对照组换无血清培养液，实验组换阿司匹林稀释液，培养24h。每孔加入20μl（5mg/ml）的MTT溶液，孵育4h后弃上清。每孔再加入150μl二甲基亚砜，温和振荡，用酶标仪进行比色，波长为490nm，对吸光度值进行比较分析。

1.2.5 Annexin V-EGFP凋亡检测：收集对照组、实验组细胞至离心管，每管细胞数≥1×105。加入500μl Binding Buffer，5μl Annexin V-EGFP，5μl PI 混匀。室温避光反应5～15min，流式细胞仪检测。

1.2.6 Real time RT-PCR检测小窝蛋白1mRNA表达：提取RNA，反转录为cDNA。应用Real time PCR检测小窝蛋白1mRNA的表达量。引物设计如下：小窝蛋白 1正义链 5′-AACGATGACGTGGTCAAGATTG-3′；反义链 5′-GCAGACAGCAAGCGGTAAAAC-3′（扩增片段长140bp）。β-actin正义链5′-CATCACCATTGGCAATGAGC-3′，反义链 5′-TCGTCATACTCCTGCTTGC-3′（扩增片段长 351bp）。采用SYBR Green作为报告染料，96孔板检测，每个样品重复3次，Ct值为3次重复所得的平均值。PCR反应条件如下：预变性95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。

1.2.7 统计学分析方法：应用SPSS 18.0统计学软件，采用One-Way-ANOVA检验法及t检验对其进行分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 UVB照射及加入阿司匹林对细胞活性的影响

MTT法检测单纯加入不同浓度阿司匹林（3，30，300μmol/L，3mmol/L）对细胞活性的影响，发现低剂量的（3μmol/L）阿司匹林可增加细胞活性，高浓度的（30，300μmol/L，3mmol/L）阿司匹林反而使细胞活性降低，故后续实验选择3μmol/L的阿司匹林作为抗氧化剂（图1A）。对于单纯进行UV照射的对照组，检测发现随着 UV 照射时间（0s，5s，10s，20s，30s）的延长，细胞活性呈下降趋势，存活率分别为90.71%，68.60%，49.70%，37.20%，可见当照射20s，照射能量达到80mJ/cm2时可达到半数致死量LD50。为研究阿司匹林的抗氧化损伤作用，所以后续实验研究的紫外线强度范围分别为0，20，40，80mJ/cm2。实验组（UV+3μmol/L 阿司匹林），细胞存活率分别为91.60%，87.19%，76.19%（图1B），明显高于对照组（单纯UV照射）。

2.2 UVB照射及阿司匹林对细胞凋亡率的影响

通过流式细胞仪，采用Annexin V-EGFP/PI双染检测对照组及实验组凋亡率，结果提示，UVA照射晶状体上皮细胞主要产生的是早期（<4h）或晚期（>20h）凋亡机制，然而UVB和UVC仅表现为晚期凋亡（24～48h）机制［4］。每组细胞设置3个平行样，经流式细胞仪检测后取均值，可见随照射时间的延长细胞的凋亡率逐渐增加19.26%，21.93%，23.77%，经ANOVA方差分析差异有统计学意义（P<0.05）。在应用阿司匹林后细胞凋亡率较相同照射剂量组有所下降分别为16.45%，17.633%，21.486%。t检验分析加药前后5s组及10s组，差异有统计学意义（P<0.05）。20s组差异没有统计学意义（P>0.05），见图2。表明凋亡细胞过多时阿司匹林将无法缓解。

2.3 UVB照射及加入阿司匹林对小窝蛋白1mRNA（cav-1mRNA）表达量的影响

Real-time RT-PCR法检测紫外线照射不同剂量及加入阿司匹林后cav-1mRNA表达水平的变化。每组剂量取3个平行样，采用Livak法的变化形式“用参照基因的△CT 法 2CT（参照基因）-CT（目标基因）”来表示目的基因表达量相对于对照组的变化。对照组（单纯UVB照射）cav-1mRNA的表达随着时间的延长呈现下降的趋势。ANOVA单因素方差分析照射不同剂量与空白对照的差异，如图3所示，显示5s，10s，20s组P<0.05，有统计学意义。t检验分析实验组（UVB+ASA）与对照组（单纯UVB照射组）cav-1mRNA的表达量，如表1所示，5s组，10s组P<0.05，有统计学意义；20s组P>0.05，没有统计学意义，表明当照射时间达到20s时，加药组和对照组cav-1mRNA表达水平无差别，阿司匹林不能使cav-1mRNA表达水平提高。

3 讨论

自然界中的紫外线根据其生物作用分为短波紫外线 UVC（200～280nm）；中波紫外线 UVB（280～320nm）；长波紫外线UVA（320～400nm）。臭氧层能够吸收全部UVC和部分UVB，而不吸收UVA。到达地表的紫外线中，部分UVB被角膜吸收，其余的UVA和UVB可穿过角膜和房水，被晶状体吸收。尽管臭氧层遭到破坏，但臭氧即使在含量很小的情况，也能完全吸收UVC。所以，臭氧层的破坏，主要是引起环境中UVB的显著增加。而到达眼的紫外线中，UVB被认为具有最强的生物损伤性［5］。Andley等［6］用单频辐射光照射人晶状体上皮细胞，发现297nm、313nm、325nm、334nm和365nm紫外线的细胞杀伤力逐渐下降，所以研究UVB，特别是295～320nm波长区域的紫外线，更具有生态学和医学意义。

表1应用阿匹林前后小窝蛋白-1mR N A相对β-a c t i n表达量的变化（±s，n=3）T a b.1T h e e x p r e s s i o n o fC a v e o l i n-1mR N Ar e l a t i v e t oβ-a c t i nc h a n g e s a f t e r a d d i n g a s p i r i n（±s，n=3）Group 0s 5s 10s 20s Control group 0.058±0.046 0.0403±0.0015 0.0293±0.0057 0.02567±0.002Experimental group 0.068±0.000571） 0.0550±0.00441） 0.0400±0.00261） 0.02300±0.0011）P ＜ 0.05vs control group.

小窝蛋白可引起信号分子的变构或共价修饰，对大多数信号分子发挥负性调节作用。但新近发现小窝蛋白并不单纯是一个信号分子的抑制剂，其对某些信号转导过程亦起到促进作用［7，8］。经过高糖处理过的晶状体上皮细胞小窝蛋白1的表达量下降，凋亡增加，表明小窝蛋白1可抑制凋亡［9］。然而Liu等［10］认为在用十字孢碱诱导凋亡的成纤维细胞和上皮细胞内，过表达的小窝蛋白1使细胞细胞凋亡率增加，可能与其抑制PI3K信号转导通路和激活caspase-3有关。小窝蛋白1敲除的小鼠表现为肺实质细胞增生，胚胎成纤维细胞表型的增加，表明小窝蛋白具有抗细胞增殖的能力［11，12］。相反的，Timme等［13］则认为前列腺癌细胞中过表达的小窝蛋白1通过抑制蛋白质磷酸酶的活性使AKt处于激活状态，这种激活状态可抑制c-myc诱导的细胞凋亡。因此尽管小窝蛋白1被认为是细胞表面用来区分促凋亡和抑制凋亡信号的枢纽，其对凋亡的调控作用还存在很多争议［14］。UV照射通过激活p38MAPK信号转导通路导致凋亡。Daniela等发现用20J/m2的UVC刺激兔晶状体上皮细胞NIH3T3，就足够激活p38MAPK信号转导通路，进而导致了小窝蛋白1酪氨酸发生了磷酸化。因此小窝蛋白的酪氨酸磷酸化可能在UV导致的细胞凋亡中重要作用［15］。本研究发现随着UVB照射剂量的加大，晶状体上皮细胞凋亡率增加，小窝蛋白1mRNA的表达水平有所下降，可以推测小窝蛋白1在氧化损伤条件下具有一定抑制凋亡的作用。

氧化损伤导致谷胱甘肽的消耗，线粒体功能的破坏，过氧化物及羟基游离基等产生，这些物质的产生最终会导致细胞凋亡［16］。阿司匹林可以减少谷胱甘肽的消耗，但是无法阻止过氧化物导致的线粒体去极化，这种抗氧化损伤作用与我们熟知的阿司匹林对COX的抑制作用不同。它是通过细胞的离子代谢途径来调节caspase活性，影响细胞凋亡，从而起到抗氧化损伤作用的。患者术后经常滴非甾体类抗炎药来抗炎止痛，但是过量应用该类药物可能会导致角膜溶解和角膜穿孔等副作用［17］。口服阿司匹林对白内障有抑制作用同时也存在风险［18］。用3mmol/L的阿司匹林处理小鼠的晶状体，3～5d后晶体出现浑浊现象，而使用低浓度0.3～3μmol/L处理的晶体还保持透明［19］。研究发现高浓度的阿司匹林可以激活caspase-3，而caspase-3的激活可以导致细胞凋亡。低浓度阿司匹林可以减少caspase-3的活性，因此找到一个既不会影响细胞功能，又能达到防止氧化损伤的剂量范围很重要。可见，研究阿司匹林对晶体上皮细胞凋亡的抑制作用，有望为白内障的临床药物治疗开辟新的前景。

本研究表明紫外线UVB照射对晶状体上皮细胞具有促凋亡作用，小窝蛋白1作为一种重要的膜蛋白可能参与细胞凋亡的调控。阿司匹林这一抗氧化剂在低浓度情况下具有保护晶状体免受氧化损伤，抑制凋亡，提高小窝蛋白-1mRNA水平的作用。

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（编辑孙宪民，英文编辑王又冬）

A Decrease ofCaveolin-1mRNA Level in Human Lens Epithelial Cells Is Associated with the UV Radiationinduced Oxidative Stress

ZHAO Fang-kun1，ZHAO Jiang-yue1，LI Qin2，YU Jia-ming1，LIU Qiu-fang3，ZHAO Xun4，ZHANG Jin-song1
（1.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110005，China；2.Center Laboratory，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China；3.Toxicology Department，China Medical University，Shenyang 110001，China；4.Center of Experiment and Technology，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the relationship between the expression ofCaveolin-1and apoptosis in human lens epithelial cells（LECs）after UV radiation and demonstrate the function of aspirin as an antioxidant.MethodsHuman lens epithelial cells SRA01/04were treated with UV 4.43mw/cm2（irradiation time 0，5，10，20seconds）.According to adding the anti-oxidant aspirin or not，the cells were divided into control and experimental group.MTT assay was used to detect the cell activity.The apoptosis rate was measured by flow cytometry.The expression ofCaveolin-1mRNA was examined by quantitative real-time RT-PCR.ResultsWith the prolonged UV radiation time，MTT measurement showed declined cell activity.Apoptosis rate was increased.Real time RT-PCR indicated decreasingCaveolin-1mRNA expression.After adding a certain concentration of aspirin，cell activity increased.In 5s and 10s groups，the expression ofCaveolin-1mRNA increased，as well as less apoptotic cells were detected compared to the control group（P<0.05），but when the radiation time reached 20s，the apoptosis rate and theCaveolin-1mRNA showed no changes compared to the control group（P>0.05）.ConclusionUV irradiation reduces the viability of cells，the level ofCaveolin-1mRNA expression，while increases apoptosis rate in LECs.Aspirin as an antioxidant can reverse this oxidative stress to some extent.But large doses of aspirin（>30μmol/L）will display the opposite function.So，to find a safe dose range also needs further study.

UV；Caveolin-1；apoptosis；aspirin；lens epithelial cell

R77

0258-4646（2011）02-0126-05

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0951.006

国家自然科学基金资助项目（30872836）（30800651）

赵芳坤（1985-），女，硕士研究生.

张劲松，E-mail：cmu4h_zjs@126.com

2010-12-28