NR1磷酸化在神经生长因子加剧大鼠骨癌痛中的作用

姚鹏，丁远远，马佳明，蒋晶晶，张锦，孟凌新

（中国医科大学附属盛京医院1.疼痛科；2.麻醉科，沈阳 110004）

NR1磷酸化在神经生长因子加剧大鼠骨癌痛中的作用

姚鹏1，丁远远1，马佳明1，蒋晶晶2，张锦2，孟凌新1

（中国医科大学附属盛京医院1.疼痛科；2.麻醉科，沈阳 110004）

目的探讨骨癌痛大鼠背根神经节（DRG）神经生长因子（NGF）表达及NR1磷酸化情况，并观察鞘内注射神经生长因子抗体（anti-NGF）对NR1磷酸化及骨癌痛大鼠疼痛行为的影响。方法 检测骨癌痛大鼠DRG NGF的表达及NR1磷酸化：雌性SD大鼠随机分成假手术（sham）组及cancer组，每组10只，分别在左胫骨注射PBS液或walker256瘤细胞，21d取左侧L4-5DRG。检测anti-NGF对NR1磷酸化及大鼠疼痛行为的影响：骨癌痛大鼠鞘内置管，随机分成生理盐水（NS）组及anti-NGF组，于接种瘤细胞16d开始分别鞘内注射生理盐水或anti-NGF。于接种瘤细胞前、接种后13、18及21d进行疼痛行为测试，接种21d取大鼠左侧L4-5DRG，Western blot方法检测NR1磷酸化。结果 与sham组比较，cancer组大鼠DRG NGF表达显著上调，NR1磷酸化水平增加（P<0.01）。鞘内注射anti-NGF后，与NS组比较，机械痛阈降低和热辐射潜伏期延长。NS组NR1磷酸化水平高于anti-NGF组（P<0.05）。结论anti-NGF减弱骨癌痛、抑制NR1磷酸化，提示NGF通过NR1磷酸化加剧大鼠骨癌痛。

神经生长因子；N-甲基-D-天冬氨酸受体；磷酸化；骨癌痛

肿瘤患者发病率呈逐年上升的趋势，Thun等［1］2010年的统计结果显示：肿瘤已成为危及人类生命的主要原因之一。据统计，70%～90%的肿瘤患者发生癌痛，乳腺癌、前列腺癌及肺癌等肿瘤容易发生骨转移而引起骨癌痛，我们前期的研究［2］显示，大鼠胫骨注射walker256瘤细胞诱发的骨肿瘤模型中，神经生长因子（nerve growth factor，NGF）加剧骨癌痛，大鼠鞘内注射抗神经生长因子抗体（nerve growth factor polyclonal antibodies，anti-NGF） 可明显抑制骨肿瘤引起的痛敏。

NGF 在炎性疼痛［3］和神经病理性疼痛［4］中发挥重要作用。电生理研究发现：伤害性感受器的兴奋性与NGF的含量密切相关。NGF不仅可直接活化感觉神经元，还可调控一些神经递质、受体、通道的活性。N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受体在炎性痛和神经病理性疼痛中发挥重要作用［5］，Traynelis等［6］也总结了 NGF 对 NMDA受体的调制作用，但是在骨癌痛中是否存在这样的调制作用尚不清楚。

我们推测NGF可以上调脊髓背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）NMDA 受体 NR1亚单位，因此本研究探讨骨癌痛大鼠背根神经节NGF表达及NR1磷酸化情况，并观察鞘内注射anti-NGF对NR1磷酸化及骨癌痛大鼠疼痛行为的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性SD大鼠，体质量200～220g，由中国医科大学附属盛京医院动物室提供。动物饲养于铺垫锯末塑料盒内，每笼5只饲养，室内温度（22±0.5）℃，湿度40%～60%，自然照明，自由摄食、饮水。实验获得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的批准。

1.2 实验分组及方法

1.2.1 骨癌痛大鼠DRG NGF的表达及NR1磷酸化：雌性SD大鼠随机分成假手术（sham）组及cancer组，分别在左胫骨注射PBS液或walker256瘤细胞，方法参照文献［2］的实验方法，每组10只，21d取左侧L4-5DRG。

1.2.2 Anti-NGF对NR1磷酸化及大鼠疼痛行为学的影响：骨癌痛大鼠接种瘤细胞13d鞘内置管，随机分成生理盐水（NS）组及anti-NGF组，每组10只，于接种瘤细胞16d开始分别鞘内注射生理盐水（10μl/只）或 anti-NGF（10μl/只，用生理盐水稀释为 1μg/μl），每日 2次，连续 5d。于接种瘤细胞前、接种后13、18及21d观察热辐射缩爪潜伏期（paw withdrawal latency，PWL）及机械性缩爪阈值（paw withdrawal threshold，PWT），接种21d测试后取大鼠左侧L4-5DRG，Western blot方法检测NR1磷酸化。

1.3 主要仪器和试剂

walker 256细胞（中国医学科学院肿瘤研究所提供），von Frey细丝（美国 Stoeling公司），BME-410A热辐射刺激仪（中国医学科学院生物工程研究所），银汞混合器（北京四泰新技术开发公司），兔抗NGF，anti-NGF及P-NR1抗血清（Santa Cruz公司）。

1.4 瘤细胞提取

walker 256细胞为来源于大鼠乳腺癌的腹水瘤细胞，保存在中国医科大学附属盛京医院中心实验室液氮罐中，用快融方法复苏并接种于大鼠腹腔传代，抽取腹水、离心、计数。

1.5 大鼠胫骨癌痛模型的建立及鞘内置管

采用以往的方法［2］建立大鼠胫骨骨癌痛模型。水合氯醛麻醉（10%，3.5×10-3ml/g）大鼠胫骨骨髓腔缓慢注入10μl含walker256的PBS细胞悬液，共含癌细胞1×105个，注射时间为2min，注射完毕后迅速用银汞合剂封住针孔，分别用75%乙醇和无菌生理盐水冲洗切口，皮肤分层缝合。sham组大鼠左侧胫骨上段注入等体积的PBS液，其余操作同cancer组。鞘内置管采用PE-10导管，L2-3椎间隙置管，导管尖端置于接近L5DRG位置，取无感觉和运动障碍的动物作为研究对象，实验结束时确认导管尖端的正确位置［7］。

1.6 PWL及PWT测定

测定热辐射刺激引起的缩爪潜伏期，将大鼠置入观察笼内，待其安静后将光辐射焦点对准足趾底中部，打开光源，从照射开始至大鼠抬腿或逃走的潜伏期作为热痛阈值，测定3次，时间间隔10min，取其平均值。为防止烫伤，将PWL的上限值定为20s；机械测试时大鼠在刺激时间内或在移开von Frey细丝时立即出现快速的缩足反应，记为阳性反应，直到找到1个纤维细丝，用其连续测试5次中有3次阳性反应，认定其为阈值（g），最高阈值设为26g，前后两次不同刺激间隔10s。

1.7 Western blot检测

大鼠接种瘤细胞后21d，水合氯醛麻醉，断头处死，取左侧L4-5DRG。应用凯基生物试剂盒（KGP350）提取胞膜蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。按每孔40μg总蛋白煮沸变性后上样，SDSPAGE电泳（成层胶浓度5%，分离胶浓度10%）分离蛋白，4℃，200mA，2h湿转印至PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别与封闭液稀释的 P-NR1抗血清（1∶1000）或 NGF抗体（1∶1000），4℃孵育过夜。然后加入稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔IgG（1∶2000）室温杂交2h，最后采用ECL化学发光法检测蛋白条带信号。每个标本重复实验3次，以β-actin为内参进行相对定量分析。

1.8 统计学分析

选用SPSS 13.0进行统计处理，计量资料以x±s表示，组间比较采用成组t检验或单因素方差分析，继以LSD或SNK处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨癌痛诱导NGF表达上调及NR1磷酸化

NGF在cancer组大鼠DRG表达显著上调，与sham组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；cancer组大鼠DRG NR1磷酸化水平也显著高于sham组。提示骨癌痛诱导NGF表达及NR1磷酸化水平上调。见图 1，2。

2.2 anti-NGF减弱机械和热痛敏并降低NR1磷酸化水平

大鼠胫骨接种瘤细胞前（基础值）PWL和PWT无统计学差异，接种13d，PWL缩短，PWT降低，大鼠出现机械和热痛敏。鞘内注射anti-NGF后，与NS组比较，PWL 延长，PWT 增高，见表 1，2。

表1骨癌痛大鼠P WL变化（±s，s）T a b.1C h a n g e s o f P WL i n b o n e c a n c e r r a t s（±s，s）Post-inoculation day 13 day 18 day 21NS 13.2±1.4 8.5±1.2 6.8±0.4 4.0±0.5Anti-NGF 13.1±1.5 8.7±1.3 9.1±0.61） 9.6±1.11）1）P<0.05vs NS group；PWL，paw withdrawal latency.Group Baseline

表2骨癌痛大鼠P WT变化（±s，g）T a b.2C h a n g e s o f P WTi n b o n e c a n c e r r a t s（±s，g）Post-inoculation day 13 day 18 day 21NS 15.9±2.4 5.5±1.1 3.9±0.6 3.7±0.6Anti-NGF 16.1±2.1 5.7±1.2 9.5±1.61） 9.8±1.21）1）P<0.05vs NS group；PWT，paw withdrawal threshold.Group Baseline

鞘内注射NS或anti-NGF后，anti-NGF组大鼠DRG NR1磷酸化水平明显低于NS组，结果显示骨癌痛大鼠DRG NGF表达上调促进了NR1磷酸化水平，见图3。

3 讨论

骨癌痛是一种机制极为复杂的慢性疼痛，涉及神经损伤所致病理性痛、瘤细胞的压迫、缺血、细胞因子及其他炎性介质释放所致的炎性痛等，共同构成骨癌痛的慢性疼痛综合征。这种复杂的、不断演变的疼痛类型导致骨癌痛很难控制。本研究中NGF在骨癌痛大鼠DRG表达显著上调。以往的一些研究显示NGF在炎性疼痛［3］和神经病理性疼痛［4］中发挥重要作用，NGF可以介导炎症和免疫反应，产生感觉超敏，当组织受到伤害性刺激时，NGF可以激活神经元终末的TrkA、P75受体，从而激活细胞内的信号级联反应，调制、活化不同的离子通道，引起中枢敏化，产生痛觉超敏或痛觉异常。一些基于骨肿瘤的研究显示，肿瘤细胞在骨髓腔内不断生长，肿瘤细胞本身会释放NGF；肿瘤浸润组织的白细胞增多，占整个肿瘤组织的80%，活化的白细胞会合成并释放大量高浓度的生长因子［8］。本研究结果提示DRG也存在NGF的高表达。

NMDA受体是一种配体门控型Ca2＋通道，在伤害性疼痛信号传导、整合过程中发挥重要作用，而NR1是NMDA受体的功能性亚单位，代表NMDA受体的活性状态。有研究显示［9］，大鼠DRG神经元中约90%显示NMDA受体样免疫染色阳性，提示外周NMDA受体在疼痛产生过程中可能起重要作用。本研究中骨癌痛大鼠DRG NR1磷酸化水平增高，显示磷酸化NR1参与骨癌痛的产生和维持过程，这与以往在炎性痛和神经病理性痛模型的研究结果一致［5］。

本研究同时显示鞘内注射anti-NGF减弱骨癌痛的机械和热痛敏，与Sevcik等［10］腹腔内注射anti-NGF缓解小鼠骨肉瘤疼痛的结果一致。疼痛行为学结果提示NGF参与大鼠骨癌痛的伤害性信号由外周向中枢的传递过程，加剧骨肿瘤诱发的疼痛。另外，anti-NGF显著抑制骨肿瘤诱导的NR1磷酸化水平。这一结果提示NGF表达上调增加了NR1的磷酸化，从而促进骨肿瘤诱发的疼痛反应，而anti-NGF缓解骨癌痛可能与抑制了NR1的磷酸化有关。然而，由于骨癌痛的复杂性及NGF的多效性，阻断NGF通路，其产生的反应也是复杂的［11］，NGF加剧骨癌痛，但并不能排除有其他信号传导通路的参与。Zou等［12］研究显示PKC抑制剂有明显的抗伤害感受作用，且其作用与抑制NR1的磷酸化有关，提示NR1磷酸化受PKC的调制。以往研究显示［13］骨髓发出的感觉传入神经纤维86%是降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）神经纤维，而几乎所有表达CGRP的纤维都表达TrkA。因此，骨肿瘤时局部释放大量的NGF与TrkA结合，激活肽能伤害感受器，促进CGRP的释放，通过PKC途径调制NR1亚单位磷酸化。另外，NMDA受体同时也存在于脊髓背角及上位中枢，传递、整合伤害性信息，我们将在今后的研究中进一步探讨NGF、NR1亚单位磷酸化在骨癌痛敏化过程中的中枢作用。

综上，anti-NGF减弱骨癌痛、抑制NR1磷酸化，提示NGF通过NR1磷酸化加剧大鼠骨癌痛。

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（编辑武玉欣，英文编辑王又冬）

Roles of NMDA Receptor NRl Subunit Phosphorylation on Nerve Growth Factor-facilitated Bone Cancer Pain in Rats

YAO Peng1，DING Yuan-yuan1，MA Jia-ming1，JIANG Jing-jing2，ZHANG Jin2，MENG Ling-xin1
（1.Department of Pain，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Anaesthesiology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo evaluate the expression of nerve growth factor（NGF）and NMDA receptor NR1subunit phosphorylation and investigate the effects of anti-NGF on dorsal root ganglion（DRG）NR1phosphorylation and pain in the rats with bone cancer pain.MethodsTwenty rats were randomly divided into sham and cancer group（n=10per group）by inoculating PBS or walker256cancer cell solution into the left tibia.On day 21，the left lumbar 4-5DRG were removed for detecting the expression of NGF and phosphorylated NR1with Western blot.Cancer rats，in which the intrathecal catheter were surgically implanted，were randomly assigned to NS and anti-NGF group （n=10per group）.Intrathecal injection of saline or anti-NGF was given from day 16to 21after inoculation.Mechanical and thermal hyperalgesia was assessed before inoculation （baseline），on day 13，18and 21after inoculation.After the behavioral test on day 21，the left lumbar 4-5DRG were removed to measure phosphorylated NR1with Western blot.ResultsThe expression of NGF and the levels of phosphorylated NR1were significantly up-regulated in the DRG of the cancer group rats compared with those of sham group.Intrathecal injection of anti-NGF attenuated the mechanical and thermal hyperalgesia compared with the rats of group NS，a reduced tendency in paw withdrawal latency（PWL）and a decreased paw withdrawal threshold（PWT）were observed in anti-NGF group rats.Phosphorylated NR1levels were significantly higher in NS group rats than anti-NGF group rats，which indicated that anti-NGF inhibited DRG NR1phosphorylation during bone cancer pain.ConclusionAnti-NGF might attenuate bone cancer pain and inhibit NR1phosphorylation，which indicated that NGF could enhance NR1phosphorylation to facilitate bone cancer pain.

nerve growth factor；N-methyl-D-aspartate receptor；phosphorylation；bone cancer pain

R738

A

0258-4646（2011）02-0117-05

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0950.005

辽宁省自然科学基金资助项目（20082111）

姚鹏（1971-），男，讲师，博士.

张锦，E-mail：jinzhang_cmu2h@yahoo.com.cn

2010-11-23