火鸡组织滴虫体外微量培养方法的改进

何 静 丁颖 彭俊宇 李芬 湖南农业大学动物医学院 长沙 408湖南桃源三尖农牧有限责任公司 湖南桃源 45700)

火鸡组织滴虫体外微量培养方法的改进

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本研究通过改进火鸡组织滴虫在M199培养液中的体外微量培养方法，为进一步研究其诊断、生活史及致病机制奠定基础。通过将人工体外培养的组织滴虫在显微镜下反复检查、稀释后用毛细吸管吸取单个虫体至1.5mL的离心管中，于40℃恒温箱中进行培养，并用镜检和PCR技术检查虫体是否增殖。结果显示有2个离心管有虫体增殖。

组织滴虫 微量培养 PCR火鸡组织滴虫（Histomonas meleagridis）是一种能引起鸡形目禽类盲肠和肝脏损伤及机能紊乱的单鞭毛寄生性原虫[1]。在最近的几十年间，组织滴虫病对养禽业造成了严重危害。通过人工模拟宿主的体内环境条件,使虫体在宿主体外完成其寄生阶段生长发育[2]，这种方法可以解决火鸡组织滴虫研究过程中缺乏所需的虫体材料的问题。到目前为止，已有许多学者成功进行了组织滴虫的体外培养[3-8]，但这些培养方法都不能获得纯的组织滴虫，其培养基中除含有组织滴虫外还含有细菌等许多杂质。本文在总结前人体外微量培养的基础上，优化分离取材、纯化及扩增的方法，获得了纯的组织滴虫，为组织滴虫病的进一步研究准备了良好的材料，并丰富了火鸡组织滴虫体外培养的研究资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫种：本实验所用的组织滴虫虫体培养的病料来自于用胚胎化的异刺线虫虫卵人工感染火鸡，使火鸡发生组织滴虫病，将发病火鸡的盲肠内容物进行体外培养所得。

1.1.2 主要试剂：M-199培养基粉、Taq酶（大连宝生物公司产品），蛋白酶K（Merck公司产品），WizardTMDNAClean-up System（Promega公司产品），PCR试剂（Buffer、MgCl2、dNTPs）为大连宝生物公司产品。

1.2 方法

1.2.1 M-199培养液的配备：用于组织滴虫体外培养所用的培养液是用购买了GIBCO公司原装M-199培养基粉末，按照说明书进行配制，4℃保存备用。使用培养液时，用灭菌吸量管吸取9mL的M-199培养液于细胞培养瓶中，另外再加入11mg灭菌米粉和15%的胎牛血清。

1.2.2 火鸡组织滴虫体外微量培养：在细胞培养瓶中加入9mL M-199培养液，其中含有无机盐、L－谷氨酰胺、25mMHEPES和L-氨基酸，另外再加入11mg灭菌米粉和15%的胎牛血清。将处于濒死期患组织滴虫病的火鸡肝脏和盲肠放在40℃恒温水浴锅上，用灭菌的剪刀将盲肠剪开，把所有盲肠内容物全部放入细胞培养瓶中，放入40℃恒温箱中进行培养。用灭菌吸管吸取一滴培养液在载玻片上，马上盖上盖玻片，放在10×40倍显微镜下进行检查。如果发现有类似组织滴虫的虫体在其中活动，用吸量管专用钳子将硼酸硅毛细吸管拉细，使其外径缩小至2.5mm，制成玻璃微量吸管。将微量吸管静止固定在显微镜上，其玻璃吸管与1个一端带有空注射器的软管相连接，并由其抽吸而成形。将含有组织滴虫的培养液

与新鲜的培养液按1∶100的比例稀释，以实现培养液视野中可以清晰地看见单个虫体。将100μL培养液随机滴数滴至载玻片上，以挑选单个虫体。用吸管吸取1滴载玻片上的培养液移至微量离心管中。整个过程用显微镜400倍放大进行监测，以确保每次只有1个虫体细胞被转移。分离后将微量离心管中加入1mL新鲜的M-199培养液，移至40℃培养4d。在第2、3、4d用光学显微镜监测虫体的生长情况。连续做平行的10个离心管，每天观察并记录每个离心管中组织滴虫的生长情况，每隔2天转种1次。通过E.Grabensteiner[9]等报道按照基因库中发布的序列号为AF293056的序列合成特异性引物进行PCR检测。将所有的阳性样品继续进行转种培养。

2 结果

2.1 组织滴虫体外培养

将处于濒死期的疑似患组织滴虫病的火鸡肝脏或盲肠内容物放入新鲜的M-199培养液中，在40℃的恒温箱中进行培养。经过48h后，在10×40倍显微镜下观察，可看到视野中有许多呈空泡状，大小约为5～30μm，形状不断变化，类似组织滴虫的虫体在视野内不断地进行钟摆状运动。

2.2 组织滴虫微量培养

将含有组织滴虫的培养液在细胞培养瓶中进行反复稀释后，直到在显微镜视野中看到1个虫体为止。然后用拉细的毛细吸管将这1个虫体吸入已加入1mL配制好的M-199培养液的1.5mL的离心管中，放到40℃恒温箱中进行培养，每天在显微镜下观察并记录组织滴虫在离心管中的生长情况，每隔2天转种1次。培养48h后观察发现，只在其中的2个离心管中发现有组织滴虫增殖，其余8管中未看见有任何虫体在其中活动，详请见表1。

2.3 火鸡组织滴虫微量培养液用于PCR检测

分别从10个进行微量培养的离心管中吸取200μL培养液进行消化后提取DNA，用特异性引物进行PCR扩增，结果如图1。

3 讨论

微量培养能够弥补采用一般的培养方法进行培养时培养液中除含有所需要的有机体外还含有许多其他杂质的不足。早在1978年Farri[10]就通过微量培养法成功地分离培养出溶血性阿米巴原虫，Oduola[11]等于1988年也采用微量培养法成功培养出疟原虫，紧接着Bushek[12]等获得了伯金斯虫单虫体分离及微量培养技术的成功。但组织滴虫的微量培养经历了一个比较长的探索过程，直到2006年M.HESS[13-14]等才首次成功通过用含有组织滴虫的M-199培养液反复稀释后，用拉细的毛细吸管在显微操作台上成功地分离出单个的组织滴虫并且感染试验动物成功，随后陆续有学者进行了组织滴虫的微量培养[15-16]。

表1 火鸡组织滴虫微量培养结果

图1 组织滴虫微量培养样品PCR产物电泳图

本次试验在显微镜下用毛细吸管共分离出10株组织滴虫，通过显微镜检查和PCR技术鉴定后发现，只有2个离心管中的虫体正常增殖，成功率只有20%。这次组织滴虫微量培养成功率很低的原因，一方面是由于组织滴虫本身对外界环境的抵抗力很弱，并且其体外没有任何囊膜对其进行保护，还可能由于水分丧失而死亡，因此存活在外界环境中的虫体非常有限；另一方面，在进行虫体分离过程中死亡或者粘在吸管壁上面而没有被转移至离心管中，也可能是由于虫体抵抗力太弱，单个的虫体在培养液中很难生长。因此，笔者建议在进行显微操作分离虫体时为虫体创造一个适宜其生存的环境。本次通过PCR方法对微量培养材料进行扩增的结果与显微镜观察结果完全一致。国外已有M.HESS[14]和E.Grabensteiner[15]等通过设计不同的引物，直接从培养液中成功扩增出组织滴虫的基因，并与鸡四毛滴虫和酵母菌相区别。

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A

1008-3847(2011)04-0002-04

国家自然科学基金（NO.30771616）和湖南农业大学2010年大学生创新性实验计划项目（YCX1025）资助。

翁亚彪