小鼠骨髓来源内皮祖细胞体外诱导培养及分化特征*

武 钧， 李建芳， 瞿 颖， 陈雪华， 汤耀卿△

(1上海交通大学医学院附属瑞金医院SICU，2上海市消化外科研究所，上海200025)

自 Asahara等［1］发现内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)以来，EPCs成为新生血管生成研究领域的焦点，其在血管内皮损伤修复方面有广阔的应用前景。分离和体外稳定培养EPCs，了解其分化的生物学特性是进行相关机制和应用研究的基础［2］。已有较多人源EPCs培养和分化特征的研究，而小鼠EPCs体外培养及分化特性的研究较少，本研究旨在探索小鼠骨髓来源EPCs的培养方法，详细观察其体外分化特征，为相关深入研究奠定基础。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 健康雄性BALB/c小鼠(8－12周，16－25g)购自上海BK实验动物有限公司。

1.2 主要试剂 vWF单克隆抗体和FITC标记的驴抗兔IgG购自Abcam;CD31和VE－cadherin单克隆抗体购自BD Biosciences;EGM－2培养液和EGM SingleQuot购自Clonetics;流式细胞技术所需荧光标记的单克隆抗体及同型对照均购自eBioscience;特级胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Hyclone;DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI－acLDL)购自Molecular Probes;内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)多克隆抗体、大鼠IgG和兔IgG购自Santa Cruz;生长因子及其它实验中所需试剂均购自Sigma。

2 方法

2.1 小鼠骨髓单个核细胞的分离与培养 颈椎脱臼法处死小鼠，严格无菌状态下分离股骨和胫骨，用含10%FBS的RPMI－1640培养液反复轻柔冲洗骨髓腔，收集单细胞悬液，用Histopaque－1083并采用梯度离心法收集骨髓单个核细胞，用0.2%台盼蓝染液进行细胞计数和活力鉴定。将细胞以2×106cells/well接种于预先包被纤维结合蛋白的6孔板内，加入EGM －2 完全培养液，于37°C、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。24 h后弃贴壁细胞并继续培养悬浮细胞，4 d后弃悬浮细胞，继续培养贴壁细胞，以后每2 d更换1次培养液。待细胞生长至70%呈融合状态时，每孔加入1 mL 0.25%胰酶，于37°C下消化并收集细胞，1∶2比例接种于培养板内继续培养。

2.2 流式细胞仪检测 分别于培养前、培养4 d、7 d、10 d、14 d用流式细胞技术对细胞表面或胞浆抗原进行检测，主要检测CD133、CD117、干细胞抗原－1(stem cell antigen 1，SCA －1)、CD31、vWF、eNOS、VE－cadherin、血管内皮生长因子受体－2(vascular endothelial growth factor receptor－2，VEGFR －2)以及CD45。

2.3 免疫荧光检测 培养7 d时，通过免疫荧光检测培养细胞 CD133、CD117、SCA － 1、CD31、vWF、eNOS、VE－cadherin和VEGFR－2的表达状况。

2.4 吞噬acLDL和结合荆豆凝集素(Ulex europaeus agglutinin I，UEA－I)能力检测

①免疫荧光检测 在培养液中以2.5 mg/L加入DiI－acLDL，培养 4 h后冲洗去除未吞噬的 DiI－acLDL，4%多聚甲醛固定细胞后以1∶20加入FITCUEA－I，室温下孵育1 h，洗涤后DAPI复染细胞核。DiI－acLDL被吞噬后使胞浆呈红色，FITC－UEA－I结合到细胞使胞膜呈绿色，双阳性细胞为2种颜色的重叠，在荧光纤维镜下呈橙黄色。

②流式细胞检测 在培养液中以2.5 mg/L加入DiI－acLDL，培养4 h后PBS洗涤以去除未吞噬的DiI－acLDL，胰酶消化并收集细胞，PBS洗涤后以1∶20加入FITC－UEA－I，室温孵育1 h，PBS洗涤后2%多聚甲醛固定细胞并上机进行检测。

2.5 EPCs增殖和迁移能力检测 培养7 d后，分别采用MTT和Transwell方法对培养细胞在不同浓度VEGF下的增殖和迁移能力进行检测。

3 统计学处理

结 果

1 骨髓来源EPCs的诱导培养和生长状况

细胞培养2 d后细胞开始变大和不规则，细胞核分裂相增多，并开始贴壁生长。3 d后可见快速分裂的细胞形成小的集落(图1A)，中间为圆形细胞，边缘少量细胞伸展呈梭形，此时的克隆样生长还不太明显，细胞体积小，伸展不是很完全，贴壁细胞多为梭形或椭圆形，部分呈线样生长(图1B)，其间混有少量纺锤形细胞，这类细胞增殖能力低，培养过程中其数量基本保持不变。第7 d，贴壁细胞形成的集落明显增多(图1C)，集落多由几十个或上百个细胞组成，集落内细胞开始向外放射状生长，形成典型的放射状集落(图1D)。10 d左右细胞基本融合，呈片状生长(图1E)，部分细胞首尾相连形成内皮细胞特异性索条状结构(图1F)。14 d左右，细胞长满培养板底部，单层细胞呈多角形融合成片状，形成典型的铺路石样外观(图1G)。将7 d形成克隆的细胞重新接种，7 d后形成具有快速增殖潜能的放射状集落(图1H)，这些细胞形成的集落明显大于早期形成的集落，常由上千个细胞组成，其增殖速度明显快于早期集落形成细胞。

2 培养分化中的EPCs表型特征的变化

培养7 d后，免疫荧光染色显示细胞膜CD133、SCA －1、CD117、VEGFR －2、CD31、VE － cadherin 及胞浆eNOS、vWF均为阳性，见图2。

Figure 1.Morphology of bone marrow mononuclear cells cultured in EGM －2 medium.After 4 d，mononuclear cells formed small colonies(A，×100)and grew in line(B，×100).After 7 d，cultur cells formed typical colonies(C，×40)，the colonies consist of a central cluster of round cells surrounded by radiating，thin and flat cells(D，×100).Cultured cells had high proliferation capacity(E，×40)and formed cord－like structure(F，×100).Cultured cells displayed endothelial cobblestone appearance at day 14(G，×100).Colony cells were re－plated at day 7.Adherent cells formed colonies with high proliferation capacity after 7 d(H，×100).图1 骨髓来源单个核细胞体外培养时形态学变化

Figure 2.Immunofluorescence identification of EPCs markers after 7 d of culture.图2 免疫荧光检测分化中EPCs表面及胞浆抗原表达情况

流式分析显示(图3)，新分离的骨髓单个核细胞CD133、SCA－1、CD117的表达率分别为0.16%、2.94%、1.26%，而4 d后贴壁细胞的表达分别达到11.05%、29.32%及16.45%，此后随着培养时间延长三者的表达率逐渐下降，至14 d其分别下降至2.29%、7.82%和3.92%;而细胞表面VEGFR－2、CD31、VE－cadherin及胞浆 eNOS、vWF在新分离细胞中的表达率分别为 0.24%、0.13%、1.55%、0.05%和0.61%，4 d后其表达明显增加，分别达到12.21%、8.43%、18.27%、7.11%和 32.61%，此后其表达逐步增加，至14 d其表达率分别达到62.13%、32.96%、67.73%、27.89%和82.16%。随着培养时间延长，白细胞通用抗原CD45的表达不断下降，培养前其表达率为54.19%，而培养14 d后其表达率仅为8.15%。

3 EPCs吞噬acLDL和结合UEA－I能力的变化

免疫荧光显示培养7 d后细胞可吞噬低密度脂蛋白及结合植物凝集素(图4A)，培养4 d后双阳性细胞达到57.18%，而14 d后为86.70%(图4B)，此后双阳性细胞数量保持相对稳定。

Figure 3.Time course of the expression of CD133，SCA －1，CD117，VEGFR －2，CD31，VE －cadherin，eNOS，vWF and CD45 by FACS analysis in bone marrow mononuclear cells.图3 培养细胞表型标志物表达状况的动态变化

Figure 4.The ability of uptaking acLDL and binding UEA－I in EPCs.A:immunofluorescence identification showed EPCs uptaking DiI－acLDL and binding FITC－UEA－I after 7 d of culture(×200);B:time course of EPCs uptaking DiI－acLDL and binding FITC－UEA－I analyzed by FACS.图4 培养细胞吞噬DiI－acLDL及结合FITC－UEA－I能力的变化

4 EPCs增殖和迁移能力的变化

通过在培养液中加入不同浓度VEGF，结果发现10 μg/L的 VEGF即可明显促进 EPCs的增殖(图5A)，随着VEGF的浓度增加，其增殖能力不同程度提高，80 μg/L VEGF可提高其增殖率约58%。随着VEGF浓度增加，其对EPCs的迁移和趋化作用明显增强(图5B)。

Figure 5.Effects of VEGF on EPCs proliferation and migration capacities.A:effects of VEGF on EPCs proliferation rate.*P ＜0.05 vs 0 μg/L and 5 μg/L group;△P ＜0.05 vs other groups.B:effects of VEGF on EPCs migration capacity.*P ＜0.05 vs 0 μg/L group;△P ＜0.05 vs 0 μg/L，5 μg/L and 10 μg/L group;#P ＜0.05 vs other groups.图6 VEGF对EPCs增殖及迁移能力的影响

讨 论

骨髓单个核细胞是多种细胞的混合群，EPCs本身缺乏特异性表面标志物［3］，所以到目前为止，没有一种简单、明确的EPCs分离方法，目前报道的EPCs分离方法主要有免疫磁珠法和差时贴壁法。我们在前期实验条件摸索过程中发现，通过免疫磁珠分离的小鼠骨髓CD117+细胞生长并不令人满意，培养2周所得细胞数量有限，这可能与分离过程中磁性微粒对细胞代谢功能产生的影响有关。Asahara在EPCs体外培养研究时发现MNCCD34+(CD34+的单个核细胞)与MNCCD34－(CD34－的单个核细胞)混合培养可以比MNCCD34+单独培养获得更多的EPCs［1］，这表明不同细胞系间相互作用或产生的可溶性因子对于EPCs的增殖分化起着重要作用，作为滋养细胞的间充质细胞、成骨细胞等在体外培养环境中对EPCs分化起辅助作用。本研究中利用EPCs贴壁缓慢的特点，采用差时贴壁法去除贴壁能力强的基质细胞、巨噬细胞以及不贴壁的造血细胞，结合纤维连接蛋白的促黏附作用，可获得较多数量和较高纯度的EPCs，培养7－14 d所得细胞数可达到进一步研究的需要。

EPCs培养需要特殊的培养基，目前研究多采用内皮细胞基础培养基，如DMEM、MEM、M199等，添加内皮细胞生长因子，如VEGF、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰岛素样生长因子－1(insulin－like growth factor 1，IGF－1)等。目前尚未有一种标准成熟的EPCs培养方法，生长因子在培养基中的浓度也各不相同［4］。对于小鼠骨髓来源EPCs的培养目前报道的方法较少，我们在预实验中采用EGM－2培养基，同时加入包含各种生长因子(EGF、VEGF、bFGF 和 IGF －1)的 SingleQuot，但是发现培养效果并不满意。经过尝试，我们发现培养液临用前适当加入 VEGF、EGF、bFGF(均为10 μg/L)可获得满意的培养效果，同时选择优质FBS对于细胞生长也非常重要。这说明小鼠骨髓来源EPCs培养条件要求比较高，采用EGM－2培养基并加入适当浓度、活性正常的生长因子可在体外稳定培养小鼠EPCs。

自培养的第4 d开始，细胞开始呈现集落生长，这与文献报道的胚胎时期“血岛”样簇状生长相类似［5］。随后细胞数量增多，细胞相互之间逐渐交联，有些细胞首尾相连呈线状生长，提示EPCs可排列成管状，最终形成血管。培养至10－14 d，贴壁细胞基本融合，细胞呈现典型的内皮细胞形态－鹅卵石状。第4 d，在弃去悬浮细胞后，贴壁细胞SCA－1、CD117及CD133的表达明显增加，这与差时贴壁及纤维连接蛋白对EPCs的筛选效应有关，随着体外培养时间的延长其表达率逐渐下降，同时白细胞通用抗原CD45的表达逐步降低，而内皮特异性抗原标志VEGFR －2、CD31、VE －cadherin、vWF 及 eNOS表达逐渐增加，这表明体外诱导培养的EPCs在逐步失去干细胞特性并向内皮细胞方向分化。

小鼠SCA－1属于Ly－6多基因家族，其主要表达于造血干细胞及祖细胞［6］。CD117又称 c－Kit，是具有酪氨酸激酶活性的蛋白质分子，是干细胞因子的受体，在早期分化的造血干/祖细胞表面均有表达，转导了造血干/祖细胞生长和分化的所需信号，CD117+细胞为一群包括了不同分化阶段干/祖细胞的异质性细胞［7］，结合SCA－1可将细胞进一步分为两个亚类:CD117+/SCA－1+和 CD117－/SCA－1+细胞。前者在多种造血生长因子联合刺激后，表现出极强的增殖能力，为相对早期的造血干细胞，不含定向祖细胞，c－Kit+/SCA－1+细胞在VEGF等内皮生长因子的作用下，可以分化成内皮细胞，说明EPCs来源于 CD117+/SCA －1+细胞［8］。CD133 是早期造血干/祖细胞的标志［9］，目前对其功能还不十分了解，多数学者认为人CD34+/CD133+/VEGFR－2+细胞为早期的EPCs，随着EPCs逐步分化CD133很快消失，而对于小鼠CD117+/SCA－1+/CD133+/VEGFR－2+细胞应当是早期的EPCs。

研究中无论是从形态学还是表型特征变化都展示了EPCs向内皮细胞分化的特征，但是到目前为止仍无法知道EPCs何时完全失去祖细胞特征而分化为成熟内皮细胞，实验中培养细胞虽然干细胞表型表达在逐步减少，但EPCs的另一重要特性，吞噬acLDL及结合内皮特异性凝集素UEA－I的能力，在培养过程却无明显丢失，传代接种后仍然有很强的集落形成和快速增殖能力，这表明所培养细胞是介于干细胞与内皮细胞之间，具有高分化潜能且处于不同分化阶段内皮前体细胞群的混合体。

VEGF是新生血管生成的主要诱导因子［10］，也是诱导内皮细胞系分化的重要诱导因子，可以动员骨髓内EPCs进入循环，并趋化其到达内皮损伤部位，促进其分化为成熟的内皮细胞，参与受损内皮的修复［11］。实验中可以看到VEGF是小鼠EPCs体外诱导培养不可或缺的重要因子，其可对离体EPCs的增殖和迁移特性产生剂量依赖性的促进作用，另外在体研究也表明VEGF对EPCs的动员和趋化及新生血管形成产生剂量依赖性促进作用［12］。

通过本研究表明，采用差时贴壁法及EGM－2内皮培养基，加入适当生长因子，在体外可以稳定培养小鼠骨髓来源EPCs。体外培养的EPCs逐步向内皮细胞方向分化，其干细胞标志物表达逐步减少，而内皮细胞标志物表达不断增加。VEGF是EPCs体外诱导培养的重要生长因子，可对其产生明显的促增殖和迁移效应。

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