正交试验探讨五灵胶囊配伍对慢性肝损伤小鼠的影响

瞿新红， 王胜春， 皇甫娟， 田卫斌

(第四军医大学西京医院药剂科，陕西西安710032)

中医方剂，或中药复方，是中医用药的主要形式与特色，因为它是中医辨证施治的具体体现和实施方式，因而复方中药配伍理论是中医药理论的基础［1-2］，开展方剂配伍规律的现代研究对于继承和发展中药配伍理论发挥临床价值有着重要意义［3-4］，也能更有效地指导临床，为中药新药研制提供依据。五灵胶囊(国药准字Z20090068)是由五味子、丹参、柴胡、灵芝制成的复方制剂，具有疏肝、益脾、活血功能，用于肝郁脾虚狭瘀症，临床用于乙型慢性肝炎治疗［5-7］。处方来源于经验方，临床应用33年。本试验采用正交设计对五灵胶囊不同配伍进行动物试验，从药效学方面探讨五灵胶囊配伍的意义。

1 材料与方法

1.1 材料 药材:柴胡Bupleurum chinense DC(陕西白水产)，北五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill(河北承德产)，丹参Salvia miltiorrhiza Bge(陕西商洛产)，灵芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst(河南芦氏栽培品种)。试剂:胆碱酯酶(CHE)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒(北京中生公司);丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。动物:昆明种小白鼠，♂性，体重(20±2)g，由第四军医大学动物中心提供，动物合格证号:SC×K(军)2002-05;仪器:半自动生化仪(MD-100型)。

1.2 方法 取昆明小鼠170只，随机分为17组，置温度(25±1)℃，相对湿度(40% ～65%)的实验室，适应环境3 d后试验。正常组小鼠皮下注射生理盐水2 mL/kg，其余各组小鼠皮下注射20%CCl4香油溶液2 mL/kg，每3 d注射1次。第3次注射后，正常、模型组灌胃蒸馏水10 mL/kg，其余各组分别给予相应受试药物，给药剂量均相当于生药10 g/kg，连续给药10 d，同时各实验组小鼠每3 d继续皮下注射20%CCl4香油溶液2 mL/kg，正常组小鼠皮下注射生理盐水。末次给药后，禁食过夜，眼眶取血，离心，取血清测定ALT;取肝组织用预冷的0.9%氯化钠溶液冲洗，置冰浴中匀化制得10%的肝匀浆，4℃12 000 r/min离心20 min，取上清测定MDA、CHE。

2 结果及分析

2.1 正交设计 选药物五味子(A)、丹参(B)、柴胡(C)、灵芝(D)为交互配伍的主要因素，对上述因素各取2水平，选用药为(1)，不选用药为(2)，因素水平安排见表1。

2.2 正交设计与结果 按正交表L16(215)安排试验，取处方量五味子、丹参、柴胡、灵芝交互配伍，加10倍量乙醇回流2次，每次1 h，滤过，合并2次滤液，回收乙醇，减压浓缩成稠膏。按上述1.2项方法进行药效学试验，结果见表2～3。

表1 因素水平

2.3 药物不同配伍对CCl4所致慢性肝损伤小鼠MDA影响结果分析 本试验中并未设置误差项，故将S值最小的因素B作为误差项，结果另外14组因素全部显著，提示正交试验没有意义。随后合并S值较小的4项B、C、BD、ABD作为误差项，其自由度为4，以F值检验作为判断指标，除配伍组A(五味子)和ABC(五味子+丹参+柴胡)无显著性，其它配伍组均显著或高度显著。由于本试验要求各试验组有降低慢性肝损伤小鼠MDA的作用，故要求K1＜K2，即R值为负数有降低MDA作用，且负值越大效果越好。实验组 D、AD、CD、ACD、BCD、ABCD 的R值为负，说明单味灵芝，五味子+灵芝，柴胡+灵芝，五味子+柴胡+灵芝，丹参+柴胡+灵芝及全方能降低慢性肝损伤小鼠肝组织MDA值，其降MDA作用顺序为CD＞D＞BCD＞AD＞ABCD＞ACD。其余4配伍组 AB、AC、BC、ABC的 R值为正，则没有降MDA的作用，结果见表4。

表2 正交试验设计与结果(n=10)U/L

表3 药物不同配伍对CCl4所致慢性肝损伤小鼠ALT、CHE、MDA的影响 (n=10)

表4 药物不同配伍对CCl4所致慢性肝损伤小鼠肝MDA的影响(方差分析)

2.4 药物不同配伍对CCl4所致慢性肝损伤小鼠肝ALT影响结果分析 合并S值较小的5项作为误差项，其自由度为5，以F值检验作为判断指标，除配伍组B(丹参)，BC(丹参+柴胡)无显著性，其它配伍组均显著或高度显著。由于本试验要求各配伍组有降低慢性肝损伤小鼠ALT酶的作用，故要求K1＜K2，即R值为负数时有效，且负值越大降酶效果越好。而配伍组 A、B、C、ABC、ABCD得R值为负，说明这5组配伍均有降低ALT酶的作用，但配伍组B(丹参)无显著性，故丹参对降低小鼠ALT酶作用不显著，其余4配伍组降ALT酶的作用顺序为A ＞ABC ＞ ABCD ＞ C。另外，配伍组AC、BC、D、ACD、BCD的R值为正，说明这5组配伍升高小鼠肝ALT值，结果见表5。

表5 药物不同配伍对CCl4所致慢性肝损伤小鼠肝ALT酶的影响(方差分析)

2.5 药物不同配伍对CCl4所致小鼠慢性肝损伤CHE影响的结果分析 合并S值较小的5项作为误差项，以F值检验作为判断指标，除配伍组AB(五味子+丹参)无显著性，其余配伍组均高度显著。由于本试验要求各配伍组有升高慢性肝损伤小鼠CHE酶的作用，故要求K1＞K2，即R值为正显示有效，且正值愈大药效作用愈强，故只有配伍组A、B、CD、BCD、ABCD能升高慢性肝损伤小鼠 CHE酶，其作用顺序为A＞ABCD＞BCD ＞B＞CD，其余配伍组C、BC、AD、ABD的R值为负，说明这4组配伍降低慢性肝损伤小鼠CHE酶，结果见表6。

表6 药物不同配伍对CCl4所致慢性肝损伤小鼠肝CHE酶的影响(方差分析)

2.6 验证 取小鼠50只，分为正常组、模型组、配伍BC组、配伍ABC组和全方组，每组10只，小鼠按上述1.2项下试验方法制备慢性肝损伤模型，各试验组给药方法及剂量同上。结果:与正常组比较，模型组ALT与MDA显著升高，CHE显著降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。与模型组比较，配伍BC组明显降低ALT，显著升高CHE(P ＜ 0.01，P ＜0.05);配伍ABC组显著降低ALT，升高CHE与MDA;全方组显著降低ALT与MDA，升高CHE(P ＜0.01，P＜0.05)，见表7。

3 讨论

采用正交设计法研究五灵胶囊各组分交互配伍对CCl4所致慢性肝损伤小鼠MDA、ALT和CHE酶水平的影响，旨在明确4种组分交互配伍后药效作用的意义和组方合理性。本试验中五味子、丹参、柴胡、灵芝是交互配伍的主要因素，按L16(215)正交列表安排试验，同一提取条件和给药剂量，测定指标为血清ALT酶水平与肝匀浆MDA值和CHE酶水平，每一试验组受试慢性肝损伤小鼠10只，采用数据取均值，15组配伍方测定结果以F值检验［8-9］显著性差异(P ＜0.01，P ＜0.05)。CCl4所致慢性肝损伤小鼠肝组织MDA增加、ALT酶水平升高和CHE酶水平下降，能够清除MDA、降ALT酶或升高CHE酶水平的因素为有效因素。就MDA和ALT而言即R值为负且负值愈大，清除自由基和降酶效果愈好，反之则没有作用;而CHE酶的R值偏向正数愈大，说明肝功能修复作用愈强。试验分析结果显示:因素D有清除慢性肝损伤小鼠肝组织自由基作用(P＜0.01)，而因素A(五味子)与因素C则无此作用，但当灵芝配伍五味子或柴胡，能增强五味子和柴胡清除肝组织自由基的作用;五味子配伍丹参、柴胡无清除肝自由基作用;丹参+柴胡，五味子+丹参+柴胡也没有降低MDA的作用，因为这5配伍组的R值为正，丹参+柴胡+灵芝和全方有显著降MDA作用。慢性肝损伤小鼠肝细胞坏死导致ALT明显升高，五味子、柴胡对慢性肝损伤小鼠血清ALT酶有明显降低作用(P＜0.05)，但二者配伍后五味子+柴胡降ALT酶作用显著减弱;灵芝无降低慢性肝损伤小鼠血清ALT酶作用，丹参有较弱的降低ALT酶作用;全方和五味子+丹参+柴胡配伍组有明显降低ALT酶。慢性肝损伤小鼠肝细胞坏死导致肝功能下降，其肝脏合成功能标志酶CHE降低，CHE合成增加意味着肝脏功能改善。五味子、丹参有升高CHE酶的作用(P ＜0.01)，但二者配伍后反而无升高CHE酶作用;柴胡、灵芝无增加CHE合成作用，柴胡 +灵芝配伍能显著升高 CHE酶(P ＜0.01);五味子+丹参+灵芝配伍组无升高CHE酶作用，而全方和丹参+柴胡+灵芝配伍组均能升高CHE酶(P ＜0.01)。验证结果显示:配伍BC组可降低ALT，升高CHE;配伍ABC组显著降低ALT，升高CHE与 MDA;全方组降低 ALT与 MDA，升高CHE，与正交试验结果趋势一致。在此实验条件下五灵胶囊配伍是合理的，综合分析相对最佳因素为全方，既降低MDA与ALT酶活性，又增加CHE酶活性。

表7 各配伍组对CCl4所致小鼠慢性肝损伤酶活性的影响 (±s，n=4)

表7 各配伍组对CCl4所致小鼠慢性肝损伤酶活性的影响 (±s，n=4)

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量/(g/kg)血清ALT/(U/L)肝匀浆CHE/(U/L) MDA 值正常组 10 mL 7.15±2.11** 89.76±11.3** 94.98±10.37*模型组 10 mL 39.39±10.60 30.00±9.35 128.50±21.07 BC组 10 g 25.81±8.67* 101.40±19.20** 133.20±41.89 ABC组 10 g 12.38±7.49** 70.49±24.16** 162.50±31.58*全方组 10 g 10.90±2.66** 61.75±36.85** 71.15±8.73**

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