银杏内酯对过氧化氢损伤的皮层神经元和SH-SY5Y细胞亲环蛋白A(CypA)表达的影响

杨俊霞，杨惠超，王东江，潘志强

1.徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室&江苏省麻醉与镇痛应用技术重点实验室，江苏徐州 221000；2.北京金康驰医药投资有限公司，北京 100142；3.河北省临漳县人民医院胸外科，河北临漳 056600

亲环蛋白A(CypA)是亲环蛋白家族主要成员，于1984年在哺乳动物细胞中首次被发现，是免疫抑制剂环孢酶素A(CyclosporinA,CsA)在细胞内的作用靶点[1]，具有肽基脯氨酸顺/反异构酶活性。研究显示，CypA在多种肿瘤细胞中高表达[2-6]，提示其与肿瘤的发生发展具有相关性。最近研究证实氧化应激和缺血时，CypA对神经元有保护作用[7-8]。

以往的研究表明，银杏内酯(ginkgolides,Gin)对氧糖剥夺和过氧化氢损伤的神经元有良好的保护作用[9-12]，但其保护机制是否与CypA的表达有关尚未见报道。为此，本研究以过氧化氢损伤的皮层神经元为模型观察Gin对CypA表达的影响，为进一步证实在过氧化氢损伤时Gin与CypA表达的关系，本研究还采用了过氧化氢损伤的SH-SY5Y细胞模型，进一步证实了过氧化氢损伤时，Gin对细胞的保护作用与CypA表达的关系。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

Gin（长沙上禾生物科技有限公司）、DMED培养基、Neurobasal Medium、B27(Gibco,USA)、胎牛血清(杭州四季青生物公司)、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物L-多聚赖氨酸、MTT、胰酶(Sigma,USA)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、Tris(上海朝瑞生物技术公司进口分装)、PVDF 膜(Bio-Rad Laboratories,USA)、抗 β-actin单克隆抗体(Sigma公司)、抗CyPA多克隆抗体 (Biomol,USA)、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔 IgG（Cell Signaling Technology,USA）免疫印迹化学发光试剂 ECL（PIERCE），Kodak 胶片(USA)，其余为国产分析纯试剂。

1.2 过氧化氢损伤的皮层神经元模型的建立

取胎龄为13～15 d的ICR小鼠，无菌条件下分离出大脑皮层，在D-Hank′s平衡盐溶液中漂洗3次，尽量剔除脑膜，剪碎后用终浓度为0.25%胰酶，37℃消化10 min，离心，弃去上清，用含15%胎牛血清的DMEM培养基制备成1.5×109cell/L密度的细胞悬液，接种于预先用L-多聚赖氨酸包被的培养板中，置37℃，5%CO2培养箱内孵育。第二天换成含2%B27的Neurobasal继续培养，隔天换液。培养至第7天，换成无血清DMEM培养基，加入新鲜配制的 H2O2，H2O2终浓度为0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L， 各浓度 H2O2分别与细胞共同孵育2 h后测细胞活力。

1.3 过氧化氢损伤的SH-SY5Y细胞模型的建立

取指数增长期的SH-SY5Y细胞，将完全培养基换成无血清的DMEM培养基，加入新鲜配制的H2O2，H2O2终浓度为0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L， 各浓度 H2O2分别与细胞共同孵育2 h后测细胞活力。

1.4 分组和药物处理

实验分为对照组(Control)、H2O2损伤组（Model）和 H2O2损伤加Gin组(Gin)。Gin用1%的二甲基亚砜溶液配制(浓度为 42.4 mg/L[9-12])，加 H2O2前 12 h加入培养基,使终浓度为42.4 mg/L；对照组、H2O2组同时加入相应量的二甲基亚砜溶液。H2O2处理前去除各组原细胞培养液，换成2 ml DMEM基础培养液，处理后即检测细胞活力。用于Western Blot分析的细胞处理后换成完全培养基12 h后提取蛋白。

1.5 细胞存活率测定(MTT法)

MTT法检测细胞活力的原理是利用活细胞线粒体脱氢酶将MTT盐还原成蓝紫色的甲瓒颗粒，以颗粒溶解后呈现的颜色深浅反映细胞活性。各组细胞培养于96孔培养板，经H2O2处理后，用D-Hank's液洗2遍，每孔加入1 g/L的MTT溶液100 μl，置于37℃，5%CO2培养箱中4 h，然后再加入100 μl，20%SDS，37℃孵育 20～24 h，用全自动酶标仪于 570 nm波长测吸光度值(A)，A值越大说明细胞活力越好。每组均设6个复孔，实验重复两次以上。

1.6 Western Blot检测CypA的表达

将培养于96孔板的各组细胞 (处理神经元与SH-SY5Y细胞的H2O2终浓度分别为0.1、0.2 mmo/L)用冰冷的PBS洗涤两遍，每空加入0.6 ml蛋白裂解液，刮取细胞，搜集到1.5 ml EP管，冰上放置30min，超声粉碎细胞，13000r/min离心10min，取少量上清液用考马斯亮蓝比色法测蛋白浓度，30 μg总蛋白量分装成一管，-20℃保存。

制胶：配制12%分离胶溶液7.5 ml(去离子水2.625 ml，Tris·HCl pH8.8 1.875 ml，29.2%Acr-0.8%Bis 3 ml，10%AP 45 μl，TEMED 15 μl)，现将上三样混匀后，取出 0.250 ml加入 5 μl 10%AP和5 μl TEMED迅速混匀，打入板中，封底，约10 min后，加入混匀的其他成分，轻轻地在顶层加入几毫升去离子水至玻片齐平。聚合完成(约30 min)之后，倒掉覆盖液体，用吸水纸吸干凝胶上部的残存液体。配制5%浓缩胶2 ml(去离子水 1.2 ml,Tris·HCl pH6.8 0.48 ml，29.2%Acr-0.8%Bis 0.25 ml，10%AP 19.2 μl，TEMED 3.8 μl)，插入梳子，小心避免混入气泡，室温下约15 min后聚合。

电泳：将样品蛋白与适量上样缓冲液混匀，100℃水浴加热5 min。将制备好的凝胶放在电泳槽上。上下槽均加入1×电泳缓冲液，检查是否渗漏。继续向上槽内添加电泳缓冲液直至充满上样孔；拔去梳子。在加样指导器的帮助下按次序上样，并加上预染的标准质量蛋白质分子。浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为100 V，至溴酚兰抵达分离胶底部后，断开电源。切下与CypA蛋白分子量（18 kD)对应的分离胶，浸入转膜缓冲液中待转膜用。

转膜：将电泳后的凝胶、甲醇浸湿过的PVDF膜(大小与分离胶相似或略大)、多孔滤垫、厚滤纸用转膜缓冲液浸泡15min。采用BIO-RAD电泳仪，用二张厚滤纸贴于两张多孔滤垫，将PVDF膜、凝胶夹于中间。PVDF膜朝正极，0℃、350 mA恒流转移2 h。转移结束后，将PVDF膜取出剪去一角以标记膜的方向，用1×TBS溶液漂洗3遍，每遍10 min。

抗原抗体反应：PVDF膜转入一盛有5%脱脂奶粉的平皿中，室温下摇床包被2 h。封闭结束后，将膜浸入加有一抗(抗 CypA 抗体 1：25 000 稀释，抗 β-actin 抗体 1：10 000 稀释)的新鲜配制的封闭液，4℃过夜。次日，用TBS溶液将膜漂洗3遍，每遍5 min。向膜的正面滴加含有二抗的封闭液，室温摇床反应2 h。取出滤膜，TBS溶液漂洗3遍，每遍5 min，用滤纸吸干膜上液体。等量吸出ECL试剂A和B(每2 cm2膜需ECL总量0.1 ml)，混匀后滴加在膜正面5 min后，将膜上的多余液体吸干，封入保鲜膜，放入压片盒中。

显影：在暗室中将胶片放在PVDF膜的正面，盖上暗盒。曝光2 min后，取出胶片放入显影液中，待条带出现后取出用自来水冲洗，放入定影液中。取出胶片，晾干，待拍照用。

1.7 数据处理和统计分析

采用Sigma Stat统计软件分析数据，各组数据以均数±标准差(±s)表示，n代表样本数。采用One Way ANOVA法对实验结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 H2O2对培养的皮层神经元和SH-SY5Y细胞活力的影响

分别用终浓度为 0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L 的 H2O2与细胞共同孵育2 h后检测细胞活力（见图1）。结果显示：随着浓度的增加，细胞活力逐渐下降。

神经元对照组与0.05 mmol/L组比较无统计学意义，与0.1 mmol/L 比较，P＜0.05， 与 0.2、0.4 mmol/L 比较，P＜0.01。SH-SY5Y细胞对照组与0.05 mmol/L比较无统计学意义，与0.1、0.2、0.4 mmol/L 比较，P＜0.01。

2.2 42.4 mg/L的Gin对H2O2损伤细胞活力的影响

根据图1提示：因0.1 mmol/L的H2O2作用神经元2 h与对照组比较，P＜0.05，既能制造神经元损伤模型，对细胞损伤也不太严重，所以采用0.1 mmol/L的H2O2作用神经元2 h来检验Gin对损伤细胞的保护作用。0.1 mmol/L的H2O2作用神经元2 h与0.2 mmol/L的H2O2作用SH-SY5Y细胞2 h的细胞活力比较无统计学意义，所以采用0.2 mmol/L的H2O2作用SH-SY5Y细胞2h来检验Gin对损伤细胞的保护作用。加入H2O2前，42.4 mg/L的Gin与细胞共孵育12 h。图2结果显示：Gin能明显抑制H2O2造成的细胞损伤，提高细胞活力。

2.3 42.4 mg/L Gin对H2O2损伤细胞CypA表达的影响

采用图2的分组方法，H2O2作用后换上加有血清的DMEM培养12 h后提取细胞蛋白，Werstern Blot检测CypA表达的变化（图3A）。结果显示，42.4 mg/L Gin预处理12 h，可提高H2O2所致的神经元和SH-SY5Y损伤细胞的CypA表达。三次独立实验结果经凝胶图像分析系统进行灰度扫描(图 3B)。

3 讨论

银杏中具有生理活性的主要化学成分为黄酮苷、萜内酯和聚戊烯醇等化合物。其中萜内酯类化合物有：银杏内酯A、B、C、M、J及白果内酯。已证明银杏内酯均为强的血小板活化因子（PAF）拮抗剂,EGb对PAF的拮抗作用可能与其降低脑损伤大鼠甘氨酸水平、减少PAF诱导的胞内钙离子水平增加、减弱蛋白激酶C(PKC)激活和降低兴奋性氨基酸受体功能等有关。银杏内酯B可通过调节超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性发挥抗氧化作用。银杏内酯B还能抑制谷氨酸对培养胎鼠皮质神经元的损伤,其机制可能是通过降低缺血时细胞内钙水平对抗谷氨酸的神经毒性[14-15]。H2O2是一种重要的活性氧成分,参与衰老、脑缺血缺氧等神经系统疾病的发病过程。它能使膜脂质过氧化,膜脂质过氧化引起细胞外钙内流激活磷脂酶和蛋白激酶[15]本实验证实银杏内酯能够提高双氧水造成的细胞活力降低。

多数研究表明，缺血预处理和低氧预适应能有效减轻神经元随后的严重缺血缺氧损伤。这些保护作用与其调动细胞内新的蛋白质合成有关[7,13]，CypA在脑组织广泛表达，能够上调过氧化物还原酶活性，抑制凋亡造成的营养因子缺乏。神经元经EPO预处理时，CypA表达上调。CypA还能与钙网蛋白结合，调节细胞内钙浓度。且能上调SOD和谷胱甘肽转移酶活性，从而发挥抗氧化功能，降低氧化应激引起的细胞损伤[17-23]。银杏内酯对缺血缺氧以及氧化应激造成的神经元损伤有保护作用[9-12]。

本研究证实银杏内酯能够提高H2O2所致神经元及SHSY5Y损伤细胞的活力，这种保护作用与其上调CypA的表达有关。

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