黄酮类化合物对钙调素的拮抗作用

崔碧玲

（佛山市妇幼保健院，广东 佛山 528000）

在研究钙调素拮抗剂的系统中，以CaM-PDE-（Ⅰ）系统研究得最为清楚。该系统的原理如下：

本实验将牛脑匀浆经过热处理后通过纤维素离子交换（DEAE-23）柱层析与葡聚糖凝胶分子筛（SephedrxG50）柱层析分离出钙调素纯品；将牛心匀浆经硫酸铵沉淀后，进行纤维维素离子交换（DEAE-23）柱层析提取出磷酸二酯酶-（Ⅰ）。由于PDE-Ⅰ既是CaM的靶酶，能水解cAMP最终产生一分子的无机磷，所以钙调素拮抗剂能降低PDE-Ⅰ对cAMP的水解作用，减少产生的无机磷。通过对反应系统最终生成的无机磷量进行测定，可以检测出CaM依赖的PDE-Ⅰ的活性，再推算出CaM的活性。

1 试剂与仪器

试剂：DEAE-23：Whatman；Sephedex G 50：Pharmacia；TFP，cAMP：Sigma；PMSF。

仪器：高速冷冻离心机（GL20A：湘仪）；紫外-可见分光光度计（U2000：日本日立）。

2 实验操作和结果

2.1 牛脑CaM提取纯化[1]

[1]，略加改动，-50℃保存牛脑冻，1∶3（W/V）加入预冷Buffer A（含25mM Tris-HCL，pH7.5，5mM EDTA-2Na；0.2mM PMSF）制匀浆。10000rpm离心30min。取上清液，沸水浴5min，立即放入盐冰浴冷却。10000rpm离心40min，收集上清液。用Buffer B（25mM Tris-HCL，PH7.5；1mM EGTA）平衡洗涤DEAE-23柱两个体积。加入上清液，用含0.15Mnacl及0.5Mnacl Buffer B各250mL线性梯度洗脱。每管按5mL/10min收集，合并含CaM管，超滤浓缩。浓缩液上Sepledex G-50柱，用含0.2Mnacl的Buffer B洗脱，每管按2.5mL/6min收集，A280测蛋白。合并CaM管，-20℃包埋保存。

2.2 牛心PDE-Ⅰ制备[2]

参考文献[2]，略加改动，操作在4℃以下进行。牛心按1∶3（W/V）加入预冷Buffer A（20mM Tris-HCL；pH7.5；1mM EDTA-2Na；1mM EGTA）制匀浆。10000rpm离心30min。取上清液，加入硫酸铵至60%饱和度，缓慢地搅拌，并加入氨水保持pH为8.0，沉淀用少量Buffer B（20mM Tris-HCL；PH7.0；1mM MGAC2；1mM EGTA咪唑；1mM EGTA；10mM β-MSH）溶解，并用Buffer B透析过液。透析后加至已用Buffer B平衡过DEAE-23柱。先用含0.05M Nacl的Buffer B洗脱至无蛋白（A280测定），再用含0.05M Nacl及0.5M Nacl的Buffer B各250mL线性梯度洗脱。每管按5mL/10mL收集。A280测蛋白，通过定磷法A610测酶活性，收集PDE-Ⅰ峰，-20℃保存。

2.3 PDE-Ⅰ，CaM活性测定方法

用两步孵浴定磷法：按表1加入试剂

表1 试剂加入量（单位mL）

30℃水浴30min后，沸水浴终止反应，冷却。加1mg/mL蛇毒0.1mL，30℃再水浴10min，加入55%三氯乙酸（TCA）0.1mL，离心15000rpm 3min。取上清液0.1mL，加入0.1M NaOH 0.2mL，25mM Tris-HCL，（pH7.5）2.5mL，试剂A（1.75%（W/V）钼酸铵-6.3%（NH4）2SO4）0.5mL，混匀后室温反应10min。试剂B（含0.35%（W/V）PVA-0.035%（W/V）孔雀绿）0.5mL后，室温反应10min后，A610测定吸光度，根据无机磷标准曲线，计算无机磷。再按：pH7.5，30℃下每分钟水解1nmol cAMP，获得Pi为下一个PDE-Ⅰ活性单位，推算酶活性。

一个CaM单位定义为上述体系中激活PDE-Ⅰ最大活性的50%时的量。

3 结 果

三种黄酮类化合物皆对CaM-PDE激活系统有拮抗作用，表明它们可通过抑制钙调素而影响PDE。其ⅠC50值分别为杨梅素：19µmol/L，槲皮素：27µmol/L，蛇葡萄素：88µmol/L。以杨梅素的作用最强。从以上实验表明三种黄酮类化合物皆为特异的钙调素拮抗剂。

4 讨 论

4.1 在分离提取钙调素时，利用钙调素耐热的性质，通过沸水浴将大量杂质蛋白变性除去。提取分离所用的缓冲系统中，都含有0.1mmol/L的氟化甲基磺酰基苯，作为蛋白水解酶抑制剂。

4.2 在检测cAMP水解终产物无机磷时，本实验使用了Vanveldhoven的定磷方法，此方法的灵敏度达µmol/L水平，因而要求实验过程严格防止无机磷的污染，

4.3 由于PDE-（Ⅰ）本身即对cAMP有轻微激活，应用cAMP-PDE-（Ⅰ）对cAMP的基础激活，限制在一定范围。

参考文献

[1]叶正华,孙大业,郭季芳.钙调素亲和层析柱的制备及其应用[J].生物化学与生物物理进展,1988,15(5):56.

[2]丁文勇,任凤,赵宝昌.钙调素依赖性的环核苷酸磷酸二酯酶的制备[J].吉林大学自然科学学报,1999,7(3):81-84.