鱿鱼皮胶原蛋白提取前处理的条件优化

王 燕 付万冬 吴亮亮 郑 斌

鱿鱼皮胶原蛋白提取前处理的条件优化

王 燕 付万冬 吴亮亮 郑 斌

试验测定了鱿鱼皮的基本组成成分，探索了酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白时前处理的最佳条件。选定了4个因素，3个水平，采用L9（34）正交试验确定了最佳条件。结果表明，4个因素NaOH浓度，NaOH作用时间、异丙醇浓度、活性炭浓度的最佳选择分别为0.15 mol/l、6 h、12%、0.8%，此时提取的胶原蛋白含量为11.08%，提取率为93.6%。

鱿鱼皮；胶原蛋白；提取；前处理

我国水域辽阔，渔业发达，鱿鱼资源突飞猛进，然而鱿鱼在加工为鱿鱼干、鱿鱼花、罐头及调味品等处理过程中约有35%的鱿鱼头、足、内脏及表皮等废弃物产生,其中鱿鱼皮占8%～13%[1]。对这些废弃物的处理,大多数工厂则采用了掩埋丢弃的方法 ,这不仅造成资源的极大浪费，更严重的是直接导致环境的污染。国外有研究发现，鱿鱼皮中胶原蛋白（collagen）含量较高[2]，牛和猪的皮通常是胶原蛋白的主要来源，然而，牛海绵状脑病、传染性海绵状脑病和口蹄疫的爆发使得人们对陆生动物来源的胶原蛋白及其衍生产品的安全性产生恐慌[3]。因此用鱿鱼皮来提取生产胶原蛋白就显得非常迫切和有意义。

有研究报道，胶原蛋白的氨基酸组成非常适合鱼虾,甘氨酸、丙氨酸是鱼虾的引诱剂,可以使鱼虾易接受到食物信息,并快速、准确捕捉到食物。天门冬氨酸等能提高鱼虾的抗病能力，精氨酸促进鱼虾的生长。若把胶原蛋白制作成胶原蛋白粉，其粘结性,可作为颗粒饲料的粘合剂 ,应用于水产饲料生产，可明显提高颗粒饲料在水中的稳定性，既可提高饲料利用率，又不易污染水质,明显降低养殖成本[4-5]；同时，胶原蛋白中的脯氨酸和羟脯氨酸,能显著促进毛发的生长,这是其它蛋白质所不可及。用于水貂、麝鼠、狐狸等名贵动物的饲料,提高它们的毛皮等级。同时也可用于牧区的羊饲料。胶原蛋白体内水解后的一些特殊肽链片段,具有免疫增强剂功效,起到抑制和杀灭病菌和病毒的作用,既起到保健作用，又可以提高羊毛的质量[6-7]。

从鱿鱼皮中提取胶原蛋白首要做的就是去除非胶原蛋白，脱色，脱腥等前处理过程，此过程的不同将对最终所得胶原蛋白质量及提取率有很大影响，本试验的目的就是探索出最佳前处理条件，希望对后期的提取工作有所帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

鱿鱼皮取自浙江兴业集团有限公司，摘掉上面的吸盘，清洗干净，剪成约1 cm长和宽的小块，放在-20℃中保存，备用，试验时4℃解冻。

1.2 仪器与药品

DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱，JJ-1精密增力电动搅拌器，KDN-08C定氮仪，脂肪测定仪，数显恒温水浴锅HH-4，JJ-2组织捣碎匀浆机，超声波清洗机，UV-2102C紫外可见分光光度计，电热套，XW-80A漩涡混合器，DELTA320 pH计，TCL冰箱。

对二甲基氨基苯甲醛，氯胺T，柠檬酸，高氯酸，NaOH,正丁醇，盐酸，L-羟脯氨酸，无水乙醇，浓硫酸等均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 成分测定

鱿鱼皮经解冻沥干，剪碎后组织捣碎。鱿鱼皮中的水分、灰分、粗蛋白及粗脂肪按常规方法进行测定[8]，鱿鱼皮中总糖采用改良的苯酚-硫酸法进行测定[9]。

1.4 提取率的确定

提取前胶原蛋白含量的测定：准确称取经前处理的鱿鱼皮1 g于碘量瓶中，加入6 M的盐酸50 ml，用电热套130℃水解8 h,水解完成后将水解物用纯水定容到100 ml，用滤纸过滤，收集滤液于锥形瓶中，取滤液1ml，用0.1mol/lNaOH调节到pH=7.0，定容到50 ml备用。取1 ml按上述方法测3个吸光值求平均值，根据回归方程求出羟脯氨酸的浓度，根据下式便知这1 g鱿鱼皮中所含羟脯氨酸的质量：W=5 000 h×10-6,h是所测得的浓度。

提取后胶原蛋白含量的测定：取木瓜蛋白酶酶解后的上清液5 ml，加入5 ml 6 M的盐酸，置于130℃烘箱中水解4 h。取1 ml水解液用纯水定容到100 ml，取其中的1 ml溶液于试管中，按上述测标准曲线的方法测吸光值，根据回归方程求出羟脯氨酸的浓度，再推测出1 g的鱿鱼皮中所含的羟脯氨酸的质量。

1.5 标准曲线的绘制[11]

制备羟脯氨酸标准储存液及标准工作液。准确吸取羟脯氨酸标准工作液 1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 ml，分别用纯水定容到100 ml，则分别是浓度为1、2、2.5、3、3.5、4、4.5 μg/ml。分别加入上述各浓度的标准液1 ml于试管中，分别加入1 ml柠檬酸缓冲液和1 ml 0.05 mol/l氯胺T溶液，25℃下氧化10 min，加入高氯酸1 ml，放置10 min，最后加入对二甲氨基苯甲醛1 ml，在65℃水浴显色10 min，冷却后在560 nm处测吸光值。以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数。

1.6 正交试验

前处理条件优化。选择NaOH浓度，NaOH作用时间，异丙醇浓度，活性炭浓度为因素，每个因素确定3个水平，按L9（34）正交表进行正交试验。其正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

2 结果与讨论

2.1 鱿鱼皮的成分

按1.3节的方法，测得本次试验所使用鱿鱼皮的基本组成成分（湿基）见表2。

从表2中可以看出，鱿鱼皮虽然是水产品加工的废弃物，但是其中含有丰富的蛋白质，粗蛋白含量达15.98%，经测定，鱿鱼皮中Hyp含量为0.78%，由于Hyp含量与胶原蛋白的含量呈正相关性，所以乘以14.2[5]得到鱿鱼皮中胶原蛋白的含量为11.1%，占总蛋白质的69.46%。因此，研究从鱿鱼皮中提取胶原蛋白非常有意义。

表2 鱿鱼皮基本组成成分

2.2 羟脯氨酸标准曲线的测定

按照1.5节的方法，测定羟脯氨酸的标准曲线，羟脯氨酸标准样品的质量浓度和吸光值如表3所示：

表3 浓度与吸光值对照

根据测定的数值，以羟脯氨酸质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线（见图1），并计算出回归方程为：y=0.096 3x+0.004 8，羟脯氨酸浓度与吸光值之间的线性相关系数r2=0.998 2（P＜0.001）,显示出羟脯氨酸浓度与吸光值之间有良好的线性相关关系。

图1 标准曲线

2.3 正交试验

按照1.6节的方法，选择了前处理中的4个因素，每个因素确定了3个水平，按L9（34）正交表进行正交试验，结果如表4所示。

对表4的试验数据进行极差分析，发现影响因素依次为 A＞C＞D＞B,最佳试验组合为 A2B2C3D2，再将该组合与正交试验中提取率最高（93.6%）的试验组合A2B2C3D1进行对比试验，结果表明，极差分析得到的最佳试验组合A2B2C3D2条件下胶原蛋白的提取率（92.7%）较A2B2C3D1略低。所以，确定A2B2C3D1为最佳试验组合，即酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白前处理的最佳条件为：NaOH浓度为0.15 mol/l,NaOH作用6 h，异丙醇浓度为12%，活性炭浓度为0.8%。

表4 正交试验结果

2.4 讨论

胶原蛋白溶于酸溶液和热水中，不溶于水和稀碱溶液，为碱不溶性蛋白[12]，去除非胶原蛋白一般采用低浓度的NaOH溶液，浓度不能太大，否则会使胶原蛋白变性。脱脂前后测定鱿鱼皮中羟脯氨酸含量，结果有显著性差异，采用ISO方法直接测定的结果显著低于经过脱脂处理的测定结果，说明脂质对鱿鱼皮中的羟脯氨酸含量测定影响很大，因此提取鱿鱼皮胶原蛋白和测定胶原蛋白含量时，宜先进行脱脂处理[1]。

3 结论

鱿鱼皮中胶原蛋白的含量较高，胶原蛋白占总蛋白的69.46%，是值得开发利用的宝贵资源。鱼皮胶原蛋白的开发需要进一步研究，使其在食品、医药、化妆品、饲料、肥料等工业中得到更加广泛的应用。

在提取过程中发现前处理中所用药品的量及作用时间不同时，提取总量也会不同，故做此试验探索前处理的最佳条件，使提取率尽量更高。

前处理的最佳条件为：NaOH浓度为0.15 mol/l,NaOH作用6 h，异丙醇浓度为12%，活性炭浓度为0.8%，提取率为93.6%。

[1] 秦玉青，刘承初.鱿鱼皮胶原蛋白的测定与回收[J].上海水产大学学报，2002,11（2）:138-144.

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[3] Yan Zhang，Wentao Liu，Guoying IA，et al.Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp（Ctenopharyngodon idella）[J].Food Chemistry，2007，103：906-912.

[4] 蒋挺大,张春萍.胶原蛋白[M].北京:化学工业出版社,2001.

[5] 王颖,陈丽娟,彭必先.鱼明胶 [J].明胶科学与技术,1997,17（3）:113-123.

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[10]ISO 3496-1994.Meat and meat products-detemination of（L-）hydroxyproline content（refemece method）[s].

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[12] 刘克海,秦玉青,徐海波,等.鱿鱼皮胶原蛋白的提取及在化妆品中的应用[J].水产科学,2008,27（8）:411-413.

The optimal pretreatment conditions for collagen from squid skin

Wang Yan,Fu Wandong,Wu Liangliang,Zheng Bin

To explore the components of squid skin and the optimal pretreatment conditions for extract collagen from squid skin by protease.Select four factors,three levels for each one,by L9（34）orthogonal experiment,the optimal conditions were determined.Results show,that the optimal selection for the four factors sodium hydroxide concentration,sodium hydroxide effect time,isopropyl alcohol concentration,activated carbon concentration were 0.15 mol/l,6 h,12%,0.8%,respectively.By this methods the content of collagen was 11.08%,extraction yield of collagen was 93.6%.

squid skin；collagen；extraction；pretreatment

S816.35

A

1001-991X（2011）07-0018-03

王燕，浙江海洋学院,316000，浙江省舟山市文化路105号浙江海洋学院005信箱。

付万冬、郑斌（通讯作者），浙江省海洋开发研究院。

吴亮亮，单位及通讯地址同第一作者。

2011-01-05

浙江省重大科技项目,项目编号：2009C13SAA00050

（编辑：刘敏跃，lm-y@tom.com）