放射线对Hela细胞TP酶影响的实验研究

阎华 杨滨

放射线对Hela细胞TP酶影响的实验研究

阎华 杨滨

目的 探讨X线照射对Hela细胞TP酶的影响，为宫颈腺癌的治疗提供新的实验依据。方法 宫颈腺癌Hela细胞体外培养，经2Gy、4Gy、6Gy放射线照射后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天收集细胞，未经照射作为对照组，采用ELISA及RT-PCR的方法对照射前后TP酶的表达进行测定。结果 Hela细胞X线照射后，与对照组相比，2Gy、4Gy、6Gy三个放射组的TP酶蛋白水平均有明显提高，放射后第3天都升高达高峰，差别有统计学意义（P＜0.01)。放射后Hela细胞TP酶的mRNA表达，在照射后第3天迅速升高达到高峰，明显高于未经照射的对照组（P＜0.05）。其升高时间与ELISA测定的TP酶蛋白水平的变化情况基本相吻合。结论 子宫颈腺癌Hela细胞经放射线照射后TP酶蛋白水平和TP酶mRNA表达均得到了提高，为放化疗联合治疗宫颈腺癌提供新的实验依据。

胸苷磷酸化酶；卡培他滨；Hela细胞；宫颈腺癌

目前，在临床上随着子宫颈癌早期诊断技术的提高，过去的少见类型宫颈腺癌现在已越来越多地被发现.宫颈腺癌因其生物学特性不同，常规的放疗及化疗效果均不明显，目前放化疗联合是针对宫颈癌治疗的主要研究方向之一[1-2]。胸苷磷酸化酶（TP）在肿瘤组织中的含量决定着对新一代抗肿瘤药卡培他滨的敏感性[3]，本研究旨在探讨X线照射对宫颈腺癌HeLa细胞TP酶的影响，为卡培他滨与放疗联合治疗宫颈腺癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1.1 人子宫颈腺癌Hela细胞的培养 Hela细胞株由中国医科大学盛京医院感染科提供用含10%胎牛血清的1640培养基，置于37℃及饱和湿度条件的培养箱中传代培养。

1.1.2 实验分组及X射线照射（瓦里安直线加速器2300C/D-SN293美国）选用处于对数生长期，状态良好的培养瓶内的Hela细胞进行实验，按X线照射的不同剂量分成对照组（未照射）、2Gy、4Gy、6Gy放射组。照射前1天更换培养液，放射组的X线照射剂量率为300cGy/min，源皮距100cm，照射后将培养瓶置培养箱内继续培养。

1.2 ELISA测定放射线照射前后Hela细胞TP酶蛋白含量

分别于照射前1天（第0天），照射后第1天，第3天，第5天，第7天，第9天收集细胞，加入PBS，在20℃条件下，进行1000r/min离心30min，离心2次，进一步超声裂解培养细胞，以13000r/min，20℃离心5min，收集上清液，考马司亮蓝法测总蛋白浓度，ELISA试剂盒（德国罗氏公司）测定Hela细胞照射前后TP酶蛋白含量，严格按照说明书操作，TP酶蛋白含量用每毫克总蛋白中的含量表示（ng/mg protein）。

1.3 TP mRNA表达的检测 Hela细胞放射线照射前后应用RT-PCR检测TP mRNA的表达。

1.3.1 提取细胞 RNA收集照射前1天（第0天），照射后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天的细胞，加入 Trizol 细胞裂解液按Trinzol试剂说明提取RNA，进行逆转录，PCR引物见表1，β-actin作为内参照，PCR扩增TP。

1.3.2 PCR扩增产物分析 PCR产物进行2%DNA琼脂糖凝胶电泳用凝聚胶成像分析系统对电泳条带进行灰度扫描，以β-actin为内参照行半定量分析，并计算TP/β-actin，从而得出两种酶相对含量。每个样本重复上述步骤3次。结果以±s表示。

表1 RT-PCR引物primer

1.4 统计学处理

实验数据采用SPSS12.0软件进行统计学处理对照组与放射组之间差异采用t检验P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放射后Hela细胞TP酶蛋白含量的ELISA测定

见表2。由表2可见，与对照组相比，Hela细胞被放射后，三个放射组的TP酶蛋白水平均有明显提高，放射后第3天都升高达高峰，差别有统计学意义（P＜0.01)，以后逐渐下降，从放射剂量上看，2Gy、4Gy放射组TP酶蛋白水平升高程度，较6Gy放射组升高有更加明显的趋势，尤其放射后第3天两者的差异有统计学意义（P＜0.05)。2Gy放射组TP酶处于高水平的持续时间更长，超过9天，第9天的TP酶蛋白水平差异仍有统计学意义（P＜0.05)。

2.2 RT-PCR半定量测定放射后Hela细胞TP酶mRNA表达

如图1、表3所示。放射后Hela细胞TP酶的mRNA表达，在照射后第3天迅速升高达到高峰，明显高于未经照射的对照组（P＜0.05）。

以后出现逐渐下降的趋势。其升高时间与ELISA测定的TP酶蛋白水平的变化情况基本相吻合。

3 讨论

胸腺嘧啶核苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）在人体多种实性恶性肿瘤组织中水平较高[4]，癌组织中TP的含量和其生物学特性有密切关系，TP酶含量高往往提示肿瘤生长较快，恶性度较高[5]。另一方面TP是卡培他滨代谢相关酶，该类药物最终在肿瘤组织中通过TP酶作用转化为5-FU发挥抗肿瘤疗效，它对肿瘤的高度选择性和特异性，使抗肿瘤作用增强，而毒副作用大大减少，其抗肿瘤疗效与肿瘤组织中TP酶的含量密切相关，一些提高肿瘤组织TP的方法包括通过放射线照射[6-7]。有文献报道[8]，在WiDR、HT-29、MN-45、MX-1、SIHA细胞的动物移植模型中，在分别给予2.5Gy、5Gy放射后TP蛋白出现了升高。

表2 Hela细胞TP酶蛋白含量的ELISA测定结果

表3 放射线照射对HeLa细胞TPmRNA相对含量（TP/β-actin的灰度比值）的影响

图1 放射线照射后Hela细胞TPmRNA电泳图

本研究通过放射线照射来观察Hela细胞TP蛋白含量及其mRNA表达的变化，实验结果表明，在放射线照射后二者均得到了提高，ELISA测定中TP蛋白含量在放射后第3天升高的较显著，达到高峰，明显高于未经照射的对照组，以后逐渐下降，在放射剂量与TP之间无明显的量效依赖关系，本实验中4Gy照射组比2Gy和6Gy组升高更显著，6Gy组升高较比另两个照射组幅度低，可能与射线剂量增加对细胞产生一定的杀伤作用有关，2Gy照射组下降的较缓慢，TPmRNA的表达与TP的ELISA测定结果基本一致，说明TP蛋白与它的基因表达间存在相关性，放射线照射是在基因水平上使TP蛋白增加。在X线照射后TP酶升高的机制尚不清楚，研究表明[9]，在应用增加卡培他滨疗效的药物或放射线后，细胞因子特别是TNF-alpha 的水平先于TP升高，这提示这些药物及放射线上调TP的主要机制是通过上调多种细胞因子主要是TNF-alpha 而使TP的表达增高。本实验的结果提示，放射线可能会提高宫颈腺癌组织TP的表达，进而提高抗肿瘤疗效。5-FU前体类药物与放射线联合治疗宫颈腺癌的方案，值得期待。

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Objective To investigate the infl uence of X-ray irradiation on the thymidine phosphorylase(TP) on HeLa cell，according to the combination therapy with capecitabine(CAP) and X-ray irradiation on cervical adenocarcinoma. Methods HeLa cells were treated with X-ray at different dosage (0Gy,2Gy,4Gy,6Gy) in vitro，the control group was 0 Gy group and were collected on day 1 day 3 day 5day 7day 9. the expression of TP protein was deteceted by the ELISA and TPmRNA were measured by the RT-PCR. Results Expression of TP protein increased by X-ray irradiation were maximally increased on day3 as compared with that in the control group was obviously different from control group（P＜0.01）TPmRNA level maximally increased by X-ray irradiation on as compared with that in the control group was signifi cantly different from control group(P＜0.05)TPmRNA increased in concordance with the change of TP protein. Conclusion The expression of TP protein and TPmRNA X-ray irradiation were maximally increased.It is expected therapy combinating capecitabine(CAP) with X-ray irradiation in cervical adenocarcinoma.

Thymidine phosphorylase; Capecitabine; HeLa cell; Cervical adenocarcinoma

10.3969/j.issn.1009-4393.2011.23.024

110031 辽宁省计划生育科学研究院附属医院（阎华 杨滨）