人胎羊膜对大鼠皮肤切创愈合中相关因素的研究

华彩红 申素芳

人胎羊膜对大鼠皮肤切创愈合中相关因素的研究

华彩红 申素芳

目的 观察人胎羊膜对大鼠皮肤切创愈合过程中感染率的影响及VEGF(血管内皮生长因子)、TGF-β(转化生长因子β)表达的研究,探讨其促进皮肤愈合及减少瘢痕形成的机制。方法 将40只雄性大鼠随机分成2组:每组20只,分为对照组与羊膜组。腹腔麻醉后,在背中线旁约1cm处做约4cm长的纵行切口,深达肌层,止血后间断缝合皮肤及皮下组织,对照组用纱布覆盖切口并包扎;羊膜组将处理过的羊膜直接贴敷在切口表面,纱布覆盖包扎。大鼠分笼饲养,给予消毒饲料及双蒸水,于切创后2、3、5、7d将大鼠脱颈椎处死,取切口处1.5cm×1.0cm皮肤组织,放入4%多聚甲醛中固定12h。固定后石蜡包埋,连续5 m厚度切片,免疫组化分析VEGF、TGF-β的表达。结果 (1)2d及3d组TGF-β创口边缘表达：羊膜组TGF-β在创口边缘表达较对照组减少P＜0.05。5d及7d组TGF-β表达实验组及对照组无明显区别。(2)羊膜组感染率(25%),较对照组感染率(50%)减少。(3)VEGF创口边缘表达：羊膜组与对照组比较P＞0.05无统计学意义。结论 (1)羊膜贴附创口能减少TGF-β的表达但对VEGF创口边缘表达无影响。(2)羊膜贴附创口能减少创口的感染率。

人胎羊膜;皮肤切创;TGF-β;VEGF

人胎羊膜属胎盘的一部分,外用具有防御功能,可阻止细菌入侵,而且羊膜抗原性非常小,故免疫排斥反应极低。鉴于此,本研究观察将胎膜贴敷创口后对创口感染率及VEGF、TGF-β的影响,为实现对瘢痕愈合的干预和治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人胎羊膜的制备和保存 新鲜羊膜取自健康剖宫产产妇的胎盘,产前查术前体检无异常,选择无胎膜早破、无胎粪污染的胎盘,从中钝性分离出羊膜,无菌生理盐水反复冲洗去除血块,自羊膜与绒毛膜间的潜在空隙钝性剥离羊膜,获得羊膜层,再用无菌生理盐水漂洗成白色(肉眼不见血丝)后置于无菌手术盘中,剪成6cm×3cm小块,然后将羊膜放入质量比为1‰的洗必泰中浸泡消毒10h,再用无菌生理盐水冲洗。

1.1.2 大鼠切创损伤模型的建立及取材 将40只雄性大鼠随机分成2组:每组20只,分为对照组与羊膜组。两组又分2、3、5、7d组,5%水合氯醛0.5～0.7ml/kg腹腔麻醉。消毒铺巾后在背中线旁约1cm处做长约4cm纵行切口,深达肌层,止血后间断缝合皮肤及皮下组织,对照组用纱布覆盖切口并包扎,羊膜组将处理过的羊膜(胎儿面)贴敷在切口表面,纱布覆盖并包扎。处理后大鼠指甲剪短,强力胶布粘裹住四爪,分笼饲养,给予消毒饲料及双蒸水,3d后换药,不换羊膜敷料,分别于切创后2、3、5、7d将大鼠脱颈椎处死,取切口处1.5cm×1.0cm皮肤组织,取材后均放入4%多聚甲醛中固定, 12h后石蜡包埋。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化染色检测TGF-β及VEGF的表达。

1.2.2 数据处理

免疫组化发现：VEGF及TGF-β阳性颗粒主要位于表皮细胞胞浆中,VEGF部分真皮微血管染色阳性,每组5张切片,每张切片随机取10个高倍视野(×400),计数视野中的阳性细胞的积分光密度,计算得出各组平均每个高倍视野的积分光密度,以±s表示。结果采用SPSS13.0统计学软件作单因素方差分析。以α=0.05为检验水准,P＜0.05为差异有统计学意义,P＞0.05为差异无统计学意义。

1.2.3 腹部切口感染诊断标准

根据国家卫生部医改司医院感染监测小组制定的医院感染诊断标准[1],由外科手术引起的皮肤破损称切口,当切口部位存在或流出脓性分泌物或示有蜂窝组织炎的红斑区,有疼痛或压痛,水肿明显,及红斑区扩大,均应列为切口感染。本试验以明显红肿或有渗液或有脓性分泌物为切口感染的主要诊断依据,结果采用SPSS13.0统计学软件作x2检验。

2 结果

2.1 TGF-β的表达

TGF-β于造创后3h在表皮细胞内表达增强,持续至伤后7d,48h达峰值,故本实验以2、3、5、7d为取材时间。结果如下:

2d组及3d组TGF-β创口边缘表达：羊膜组TGF-β在创口边缘表达较对照组减少P＜0.05。5d及7d组TGF-β表达实验组及对照组无明显区别,P＞0.05。见表1。

表1 两组大鼠皮肤切创2、3、5、7d的TGF-β表达结果(±s,n=5)

表1 两组大鼠皮肤切创2、3、5、7d的TGF-β表达结果(±s,n=5)

天数 组别 切创例数 积分光密度2对照组 5 0.657±0.061 2羊膜组 5 0.476±0.035 3对照组 5 0.616±0.034 3羊膜组 5 0.446±0.030 5对照组 5 0.154±0.011 5羊膜组 5 0.159±0.015 7对照组 5 0.151±0.011 7羊膜组 5 0.152±0.01

2.2 感染情况

羊膜组感染率(25%)较对照组感染率减少,P＜0.05。见表2。

表2 两组大鼠切口感染率的比较

2.3 VEGF表达情况

VEGF创口边缘表达：羊膜组与对照组比较P＞0.05，无统计学意义。

本试验还发现,切创肌肉中VEGF 3d开始表达并逐渐增强,但对照组与实验组无统计学差异,说明羊膜外敷创口仅对创口表层有影响,对创口深层无影响。

3 讨论

TGF-β是公认的促纤维化细胞因子,是纤维化的代表性因子,Whitby等[2]发现胎儿伤口的无瘢痕愈合与TGF-β的缺乏有关,成年动物伤口愈合过程中,血小板的a颗粒是早期伤口中TGF-β的主要来源[3],而胎儿伤口无瘢痕愈合中胎儿血小板a颗粒中TGF-β含量较少,受伤后胎儿血小板在伤口中聚集也较少[4],使早期胎儿伤口中TGF-β水平较低,而低TGF-β水平又使伤口中缺乏或极少巨噬细胞浸润,进一步减少TGF-β在伤口局部出现的机会,TGF-β水平的相对缺乏可能是胎儿伤口无瘢痕愈合的重要原因。TGF-β的存在是成年动物伤口愈合所必需的,但其过度的作用会导致组织损伤,加重瘢痕形成,因此应用对抗TGF-β的疗法可能会减少瘢痕形成和治疗成年动物的纤维性疾病。Shah等[5]在成年鼠的伤口中应用TGF-β多克隆中和抗体减少TGF-β水平以模仿胎儿的伤口环境,通过这种处理后成年鼠伤口中疤痕明显减少,与没有处理的伤口比较,处理的伤口张力正常,在组织学上接近于正常结构。但由于抗体存在抗原性的问题,激素类抑制免疫反应增加感染机会等副作用使这些药物临床上应用受限,如何使用安全有效的方法减少伤口中TGF-β含量尚未见报导。

VEGF是一种功能强大并能产生多种生物学效应的细胞因子,是对血管有高度特异性的生长因子,对血管再生起着关键的作用[6]。VEGF局部应用可使创面上皮化的时间比未使用VEGF的创面提前1d完成,但持续应用则过度瘢痕形成。本试验发现,切创肌肉中VEGF 3d开始表达并逐渐增强,但对照组与实验组无统计学差异,说明羊膜外敷创口仅对创口表层有影响,对创口深层无影响。

羊膜是人体中最厚的基底膜,羊膜可以产生多种生长因子,增强了上皮细胞的粘附,并具有抗炎、抗纤维化、抗新生血管作用、促进细胞的凋亡及抗病原微生物等功能[7]。羊膜具有以下特征:容易获得,制备简单,容易满足要求：具有一定的韧性,容易展开,贴于切口表面,能阻止细菌等微生物穿过而防止感染;为网孔状结构,可允许小分子物质通过,相当于存活组织;免疫排斥反应极低,既不会出现异体皮而引起感染[8],又避免了由此而引起的自体皮不长,推迟创面愈合[9];羊膜含有生物源性刺激素,可促进肉芽组织及上皮生长,加速创面愈合[10];刺激上皮细胞分化,通过抗蛋白酶的活性,清除炎症细胞。

成年人及动物皮肤的切口愈合过程即为瘢痕形成的过程。在临床工作中,应用TGF-β促进伤口愈合的方法会导致伤口局部的胶原合成增加,导致瘢痕增生。而使用瘢痕减少的治疗方法(如糖皮质激素,细胞毒因子等)则可导致伤口愈合的延迟。迄今为止,试图在促进伤口愈合的同时又减少瘢痕或无瘢痕形成仍是一个有待研究的困难问题。

成年人伤口愈合均以瘢痕形成作为结束,根据身体条件的不同,有时有过度瘢痕形成,有时会出现伤口愈合延迟,有时则表现为瘢痕增生。促进伤口愈合和减少瘢痕形成是很多研究人员所希望达到的目的,但两者之间存在矛盾。

TGF-β使伤口中胶原含量增加促进伤口愈合,但这正是瘢痕形成的重要原因之一,而防止瘢痕过度产生的治疗方法如局部应用免疫抑制剂等减少TGF-β表达会使伤口愈合延迟,增加感染机会。减少感染机会并减少TGF-β含量是我们课题研究目的之一。本研究发现羊膜贴附创口能减少纤维化的代表因子TGF-β的表达;能减少创口的感染率,促进创口的愈合。羊膜不仅安全,而且价格低廉,为临床研究提供了很好的理论基础及方向。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2011.18.020

河南省科技厅资助项目 (082102310084)

453100 新乡医学院第一附属医院妇产科 (华彩红) 456700新乡医学院第三附属医院妇产科 (申素芳)