白藜芦醇对胃癌细胞Ras相关结构域家族1A基因甲基化及表达的影响

黄明明 蔡卫东 刘永辉

白藜芦醇对胃癌细胞Ras相关结构域家族1A基因甲基化及表达的影响

黄明明 蔡卫东 刘永辉

目的 探讨白藜芦醇对人胃癌SGC-7901细胞Ras相关结构域家族1A（RASSF1A）基因甲基化及蛋白表达的影响。方法 体外培养SGC-7901细胞，用不同浓度(0，10μM，20μM，40μg/ml)白藜芦醇与其孵育48h。采用甲基化特异性PCR（MSP）检测RASSF1A基因启动子区域的甲基化改变情况；RT-PCR检测RASSF1A的表达水平，并用Western blot检测处理前后RASSF1A蛋白的表达。结果 白藜芦醇能以剂量依赖性方式抑制SGC-7901细胞增值，随着SNF浓度的增加，甲基化RASSF1A水平逐渐减弱，非甲基化RASSF1A水平逐渐增多。同时白藜芦醇能明显上调RASSF1A的mRNA和蛋白表达水平。结论 白藜芦醇能使RASSF1A基因去甲基化，并上调非甲基化基因的表达水平，可能是其抗癌的重要因素。

白藜芦醇;胃癌;Ras相关区域家族1基因

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤。和其他恶性肿瘤一样，胃癌的发生是由多因素、多步骤的复杂过程，涉及到机体细胞的基因及表型的改变[1]。近年来的研究发现，RAS相关结构域家族1A基因与胃癌的发生发展密切相关，可能是一种新型的抑癌基因[2-3]。在本研究中，我们探讨了白藜芦醇对人胃癌细胞SGC-7901 RASSF1A基因的甲基化以及表达情况的影响，从而为探讨其临床辅助治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 细胞和主要试剂

胃癌SGC-7901细胞株购自中科院上海细胞库。RPMI-1640培养基以及胎牛血清均分别为Invitrogen和杭州四季青公司产品。SFN(纯度＞99%)购自Sigma公司，用二甲基亚砜(上海生工)溶解，4℃避光保存。细胞基因组提取试剂盒以及RNA酶购自大连宝生物。Trizol试剂、RT-PCR试剂购自Qiagen公司。β-actin多克隆抗体、HRP羊抗鼠IgG购自北京中杉公司，抗RASSF1A抗体购自eBioscience公司。

1.2 细胞培养与处理

SGC-7901细胞于37℃，5% CO2条件下，用含10%肽牛血清、1mM 谷氨酰胺、1%青霉素、1%链霉素的RPMI-1640培养基中培养。当细胞生长至对数期后，加入终浓度为0，10μM，20μM，40μg/ml白藜芦醇处理48h。

1.3 甲基化特异性PCR（MSP）

按照试剂盒提供的方法获取SGC-7901细胞全基因组DNA，用亚硫酸氢钠修饰、纯化基因组DNA。设计针对RASSF1A基因甲基化和非甲基化的特异性引物，并按照参考文献提供的方法对其进行扩增[4]。扩条件为：94℃预变性7min；随后进入35个循环：95℃变性30s→56℃复性30s→72℃延伸30s。最后一次循环结束后于72℃反应5min。

1.6 RT-PCR

Trizol法提取处理后细胞的RNA，用Qiagen公司提供的试剂盒对RASSF1A基因的mRNA水平进行扩增。PCR产物经琼脂糖凝凝胶电泳后，将其与β-actin的灰度比值进行半定量分析。

1.7 Western blot

白藜芦醇作用SGC-7901细胞后，加入等体积2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸3min。超声处理后取20μl蛋白进行SDSPAGE，转印至硝酸纤维素膜（Millipore）后，用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭2h，用TBST液洗膜后，4℃下孵育一抗过夜。洗膜，加入HRP标记二抗室温孵育1h。ECL发光、显影，灰度扫描。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 白藜芦醇处理对SGC-7901细胞RASSF1A甲基化的影响

SGC-7901细胞在0h可观察到RASSF1A基因呈高甲基化。当其用10～40μM 白藜芦醇处理48h后，RASSF1A基因的甲基化水平随白藜芦醇浓度的增加而降低。同时，而非甲基化条带增加，如图1所示。

图1 白藜芦醇对胃癌细胞RASSF1A基因甲基化影响M：甲基化基因；U：非甲基化基因

2.2 白藜芦醇对SGC-7901细胞RASSF1A mRNA表达的影响

SGC-7901细胞经不同浓度白藜芦醇处理48h后，RASSF1A基因mRNA表达明显增强。经灰度软件Quantity One扫描后，其RASSF1A /β-actin灰度值改变情况见表1。

表1 白藜芦醇对胃癌细胞RASSF1A/β-actin mRNA灰度比值的影响（±s）

表1 白藜芦醇对胃癌细胞RASSF1A/β-actin mRNA灰度比值的影响（±s）

注：abc分别与对照组比较，P值均＜0.01；10μM、20μM和40μM各组两两比较，P值均＜0.01。

白藜芦醇浓度（μM） 重复次数（n） RASSF1A/β-actin（灰度值）0 3 0.09±0.02 10 3 0.24±0.04a 20 3 0.35±0.05b 40 3 0.47±0.04c F值 — 51.459

2.3 白藜芦醇对胃癌细胞RASSF1A蛋白表达的影响

白藜芦醇前，RASSF1A蛋白表达含量低，白藜芦醇处理后，随着浓度的增加，RASSF1A蛋白水平明显升高。而内参β-actin在所有组中表达水平保持不变。见表2所示。

表2 白藜芦醇对SGC-7901细胞RASSF1A/β-actin蛋白表达的影响（±s）

表2 白藜芦醇对SGC-7901细胞RASSF1A/β-actin蛋白表达的影响（±s）

注：abc分别与对照组比较，P值均＜0.05；10μM、20μM和40μM各组两两比较，P值均＜0.05。

白藜芦醇浓度（μM） 重复次数（n） RASSF1A/β-actin（灰度值）0 3 0.07±0.02 10 3 0.25±0.04a 20 3 0.41±0.06b 40 3 0.54±0.11c F值 — 27.225

3 讨论

虽然根治性手术能大大提高早期胃癌患者的生存率[5]，但对于术后患者或已转移的患者而言，化疗依然是重要的治疗手段。用于胃癌化疗的药物很多，但现有的药物疗效依然难以达到满意的疗效，因此开发和寻求新型治疗药物依然是当今临床工作者不懈的追求。

随着肿瘤分子生物学的发展，抑癌基因甲基化引起了学者们的广泛关注。在众多的抑癌基因当中，RASSF1A基因已成为当前研究的热点，在胃癌患者中，RASSF1A启动子区域甲基化的发生率可高达90%以上。抑癌基因甲基化导致其转录异常，从而可能引起细胞异常增殖。因此逆转RASSF1A基因甲基化有望成为胃癌治疗的重要途径。

白藜芦醇是一类非黄酮多酚类物质，是葡萄属植物为抵抗外界刺激如紫外线、真菌、病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒素[6]。现代药理学表明，白藜芦醇除了具有抗炎、抗氧化、调节血脂等作用外，还能影响多条肿瘤相关途径，从而抑制肿瘤细胞的生长[7]。在本研究当中，我们发现SGC-7901细胞静息状态下，细胞内可扩增出明显的甲基化RASSF1A基因和非甲基化条带，表明该细胞在正常状态下部分RASSF1A基因处于甲基化状态。当SGC-7901细胞与40μM白藜芦醇孵育48h后，甲基化条带明显减弱，而非甲基化基因有所增加，表明白藜芦醇能逆转肿瘤细胞RASSF1A基因的甲基化状态。随后的研究也证实白藜芦醇能在mRNA和蛋白水平增加RASSF1A基因的表达水平。

白藜芦醇抑制RASSF1A基因甲基化的机制目前仍不甚明了，在DNA甲基化的过程中，甲基供体不足，或者通过去甲基化机制使肿瘤细胞重新激活抑癌基因可能是其作用的方式[8-9]，但这有待进一步研究。总之，本研究证实了白藜芦醇的去甲基化效应，有望成为胃癌的辅助用药。

[1]范东风.胃癌的癌前期病变与胃癌的早期诊断及治疗[J].当代医学,2011,17(12):102-103.

[2]刘培,姜相君,葛银林.RASSF1A基因启动子区甲基化在胃癌组织中的检测[J]. 世界华人消化杂志,2009,17(30):3144-3147.

[3]任希才,姜相君.抑癌基因RASSF1A mRNA在胃癌中的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学,2011,19(03):501-504.

[4]Kioulafa M,Kaklamanis L, Mavroudis D, et al. Prognostic significance of RASSF1A promoter methylation in operable breast cancer[J]. Clin Biochem, 2009,42(10-11):970-975.

[5]骆曦图.全胃切除术治疗胃癌27例临床探讨[J].当代医学, 2011,17(09):64.

[6]樊慧婷,熊晓云,曹蔚,等.白藜芦醇烟酸酯与白藜芦醇体内外抗肿瘤作用比较[J].中国新药杂志,2006,15(11):874-878.

[7]Gupta SC,Kannappan R,Reuter S,et al.Chemosensitization of tumors by resveratrol[J].Ann N Y Acad Sci,2011,1215(1):150-160.

[8]Mazue F,Colin D,Gobbo J,et al.Structural determinants of resveratrol for cell proliferation inhibition potency:experimental and docking studies of new analogs[J].Eur J Med Chem,2010,45(7):2972-2980.

[9]Jeong SH, Jo WS, Song S, et al.A novel resveratrol derivative, HS1793,overcomes the resistance conferred by Bcl-2 in human leukemic U937 cells[J].Biochem Pharmacol,2009,77(8):1337-1347.

Objective To investigate the effect of Resveratrol on RASSF1A methylation, mRNA and protein expression in Human gastric cancer SGC-7901. Methods The cultured SGC-7901 cells were incubated with 0,10μM,20μM,40μM of Resveratrol for 48h. After that, the changes of methylation in RASSF1A promoter region was determined by methylation-specif c PCR. The mRNA level of RASSF1A was detected by RT-PCR, and the protein level of RASSF1A was detected by Western blot. Results Resveratrol could inhibit SGC-7901 cells proliferation in dose-dependent manner. With increasing concentrations of Resveratrol, the level of methylation of RASSF1A gradually became weaker, while non-methylation of RASSF1A levels gradually increased. Both the mRNA and protein expression of RASSF1A levels can be signif cantly upregulated by Resveratrol. Conclusion Resveratrol can make demethylation of RASSF1A ,but not the upregulation of non-methylation expression , which may be one of the mechanisms of its antineoplastic activity.

Resveratrol;Human gastric cancer;Ras-association domain family 1

10.3969/j.issn.1009-4393.2011.18.013

421900 南华大学附属第三医院普外科 (黄明明 蔡卫东刘永辉)