4种果蔬种子带菌的种类及其抗药性

张传清，张雅，朱祝军

（1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安，311300；2.杭州市农业科学研究院）

4种果蔬种子带菌的种类及其抗药性

张传清1，张雅2，朱祝军1

（1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安，311300；2.杭州市农业科学研究院）

采用离体平皿法对西瓜、黄瓜、番茄和茄子4种果蔬种子进行了带菌检测，并测定了检测到的主要真菌种类对常见杀菌剂的抗药性。结果表明，西瓜种子表面携带的优势菌群为根霉（Rhizopusspp.）和青霉（Penicilliumspp.），黄瓜为青霉和曲霉 （Aspergillusspp.），番茄和茄子为毛霉（Mucorspp.）和丝核菌（Rhizoctoniaspp.）；4种种子内部寄藏的真菌都主要为青霉和根霉。抗药性检测结果表明，4种果蔬种子对苯并咪唑类杀菌剂已经产生了严重的抗药性，而对福美双和咯菌腈无抗药性。

种子带菌；种子处理；杀菌剂；抗药性

西瓜、黄瓜、番茄和茄子都是重要的蔬菜作物，近年来因病害等导致的连作障碍问题日益突出。种子处理是控制果蔬种苗病害最经济有效的途径之一，而科学的种子处理技术是建立在对种子的带菌种类、药剂敏感性及种苗期主要种传和土传病害发生情况研究的基础之上的[1，2]。目前关于番茄和茄子带菌的报道很少，大多集中于西瓜和黄瓜带菌的研究。如印度主栽西瓜品种种子带的真菌种类主要为丝核菌（Rhizoctoniaspp.）和镰刀菌（Fusariumspp.）[3]，李健强等[1]报道的新疆地区西瓜种子传带的主要真菌种类为青霉（Penicilliumspp.）和根霉（Rhizopusspp.）。同时，国内有关种子病理学的研究主要由中国农业大学等北方机构完成[4，5]，其研究采用的品种基本为北方的主栽品种。另外，很多植物病菌已经对多菌灵、甲基硫菌灵等苯并咪唑类杀菌剂产生了抗药性[6]，而这类药剂在种子处理中也已经使用很长时间，却没有见到有关植物种子对其抗药性的研究。因此，本研究主要对我国东部西瓜、黄瓜、番茄和茄子品种种子进行带菌检测，并测定检测到的真菌对常见种子处理药剂的敏感性，以期为科学的种子处理技术提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为黄瓜种子中农8号、津研4号和汉玛；番茄种子合作903、浙杂809和以色列180；茄子种子杭茄3号、杭丰1号和达拉斯；西瓜种子丰乐5号、西农8号和领先168，均购自市场。

供试杀菌剂为98%多菌灵（Carbendazim）、97%福美双（Thiram）和95%咯菌腈（Fludioxonil），原药均由农业部农药检定所提供。除多菌灵用0.1 mol/L HCl溶解，其余均用丙酮溶解，配制成10 mg/mL的母液备用。

1.2 试验方法

①种子外部带菌检测 每个品种随机选取200粒种子，放入50 mL锥形瓶中，加入20 mL无菌水充分振荡，吸取悬浮液5 mL，以4 000 r/min的转速离心20 min，弃上清液，再加入1 mL无菌水充分振荡、浮载后吸取100 μL加到直径为9 cm的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上涂匀，放入25℃培养箱中黑暗条件下培养3～7 d后观察，记录种子外部带菌种类和分离比例[4，5，7]。每个处理5次重复，相同操作条件下设无菌水为空白对照（CK）。

②种子内部带菌检测 将每个品种的黄瓜种子在5%NaClO溶液中浸泡3 min，用无菌水冲洗3遍，取100粒种子剖开种壳和种仁，于1%NaClO溶液中浸泡1 min，用无菌水冲洗3遍。将同一品种的整粒种子、种壳和种仁分别均匀摆放在直径为9 cm的PDA平板上，每皿摆放10～20粒或10～20个组织块，在25℃培养箱中黑暗条件下培养3～7 d后,检查记录带菌情况、不同部位的真菌种类和分离频率[4，5]，每个处理5次重复。

③种子带菌鉴定 将分离到的真菌分别进行纯化、镜检和转管保存。根据真菌培养性状和形态特征，参考工具书进行鉴定[8，9]。

④对杀菌剂的抗药性检测 随机从各品种种子分离得到的各类真菌中每类取20个左右菌株，对于检测到总菌株数少于20个的，则测定所有菌株。将各菌株先在PDA平板上培养5 d活化，然后在同一圆周上制取菌丝块（直径0.5 cm），转移到含不同浓度供试药剂的PDA平板中央，25℃培养3～ 5 d后观察生长情况。各平板上最终所含有机溶剂浓度均小于1.0%，以不含药剂者为对照（CK），每处理重复3次。对于多菌灵，不能在含5 mg/L多菌灵的平板上生长的为敏感菌株，能在含100 mg/L多菌灵的平板上生长的为高水平抗性菌株。对于福美双和咯菌腈，根据各处理的菌落直径（cm），取平均值计算抑制率（%），通过浓度对数值（X）和抑制率几率值 （Y）之间的线性回归关系求出毒力回归方程和EC50值。根据EC50值来确定是否已经产生抗药性[10]。

抑制率 （%）=[（CK菌落直径-处理菌落直径）/（CK菌落直径-0.5）]×100%。

表1 4种果蔬种子外部携带的真菌种类及分离比例

表2 4种果蔬种子内部携带的真菌种类及其分离比例

表3 4种果蔬种子携带的真菌对多菌灵的抗药性频率 %

2 结果与分析

2.1 种子外部带菌种类及比例

黄瓜、番茄、茄子和西瓜4种果蔬种子外部平均带菌率分别为17.2%，33.63%，32.9%和39.9%。不同作物间带菌种类情况有明显差异，黄瓜为青霉和曲霉，番茄和茄子为毛霉和丝核菌，西瓜种子表面携带的优势菌群为根霉和青霉。同一作物不同品种间带菌的种类和比例也有明显差异（表1）。

2.2 种子内部带菌种类及其比例

黄瓜、番茄、茄子和西瓜4种果蔬种子内部带菌率显著低于外部，平均带菌率分别只有3.4%， 11.2%，1.6%和14.6%，且所带的真菌的种类要少，优势带菌种类均为青霉和根霉（表2）。

2.3 种子带菌的抗药性检测结果

各个品种中分离得到的各类真菌对福美双和咯菌腈都没有产生抗药性，仍然属于敏感菌株的范畴；对苯并咪唑类杀菌剂如多菌灵已经产生了严重的抗药性。其中4种果蔬12个品种的种子中分离得到的青霉、曲霉、根霉和毛霉对多菌灵的抗药性频率均为100%；链孢霉的抗药性频率在0～100%，平均为56.6%，丝核菌的抗药性频率在12.5～100%，平均为91.3%，其他菌的抗药性频率在50%～100%，平均为90%（表3）。

3 小结与讨论

研究了4种果蔬12个品种种子的带菌情况，结果表明，各品种种子内部的带菌率比外部低，内部携带的真菌种类要少，且品种间的差异小，所有品种种子内部寄藏的真菌都主要为青霉和根霉，这与前人[4，5]有关黄瓜和西瓜不同品种种子带菌的研究结果类似。而种子外部的带菌种类和比例在作物和品种间都有明显的差异，西瓜种子表面携带的优势菌群为根霉和青霉、黄瓜为青霉和曲霉、番茄和茄子为毛霉和丝核菌。这意味着进行种子处理时，一定要对拟处理种子的带菌情况进行研究，才能有针对性地处理并获得较好的效果。

除了带菌的种类和比例，所带菌对药剂的敏感性也是影响种子处理效果的主要因素之一。杀菌剂抗药性是指本来对药剂敏感的野生型植物病原物个体或群体，由于遗传变异而对药剂出现敏感性下降的现象。国内在种子处理时选用的药剂比较单一，非常容易导致抗药性的产生，但国内外还没有相关的报道。本研究表明，供试的所有品种上分离得到的青霉、曲霉、根霉和毛霉对多菌灵的抗药性频率均为100%，链孢霉等其他类型真菌对其抗药性频率也在56.6%以上。这说明对多菌灵、甲基硫菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性已经非常严重，在实践中应该慎用，而所有检测到的真菌都没有对福美双和咯菌腈产生抗药性，在生产上可以继续选用。

[1]李健强，沈其益.杀菌剂处理种子防治作物种苗期病害研究进展[J].中国农学通报，1994，10（6）：16-19.

[2]黎裕.种子处理的应用与进展[J].种子，1990（1）：44-46.

[3]Pushpa K,Borkar G M,Patil D V.Studies on seed borne pathogensof pumpkin,cucumber,watermelon and muskmelon[J].Journal of Soils and Crops,1999,9(2):234-238.

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[5]毕扬，王燕，张文华，等.黄瓜种子带菌检测及杀菌剂消毒处理效果[J].种子，2007，26（1）：11-14.

[6]Ma Z H,Michailidea T J.Advances in understanding molecular mechanisms of fungicide resistance and molecular detection of resistant genotypes inPhytopathogenicfungi [J].Crop Protection,2005,24:853-863.

[7]方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998：46.

[8]周与良，刑来君.真菌学[M].北京：高等教育出版社，1986：472.

[9]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979：780.

[10]Zhang C Q,Hu J L,Wei F L,et al.Evolution of resistance to different classes of fungicides inBotrytis cinereafrom greenhouse vegetables in eastern China[J].Phytoparasitica, 2009,37(4):351-359.

Isolation and Preliminary Identification of Seed-borne Fungi of Four Fruits or Vegetables and their Resistance to Fungicides

ZHANG Chuanqing1,ZHANG Ya2,ZHU Zhujun1
(1.College of Agriculture and Food Science,Zhejiang Agriculture and Forestry University,Lin'an,Zhejiang 311300; 2.Hangzhou Academy of Agricultural Sciences)

Seed-borne fungi of four seeds were tested by the method of petri dish,and their resistance to fungicides was detected.The results showed that the predominant fungi on the surface of watermelon were rhizopus and penicillium.For cucumber seeds,they were penicillium and aspergillus.For tomato and eggplants seeds,they were mucor and rhizoctonia. Moreover,serious resistance has developed to benzimidazole fungicides in isolated fungi of all tested seeds.However, these detected seed-borne fungi were still very sensitive to thiram and fludioxonil.

Seed-borne fungi;Seed treatment;Fungicide;Resistance

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.04.020

浙江省科技厅重大专项“环境友好型蔬菜种子处理关键技术的研究与示范”（2008C12003-2）

张传清（1976-），男，博士，副教授，主要从事植物病害治理及杀菌剂药理学与抗药性研究，电话：0571-63742089，E-mail：cqzhang9603@yahoo.com.cn

2010-08-17