芹菜叶总黄酮的光谱测定及清除羟基自由基性能

张斐飞,张丹妮,郑宇强,岑璐局,朱妙琴

(浙江外国语学院理工学院,浙江杭州310012)

1 前 言

芹菜异名药芹、旱芹,属伞形花科的一年生或二年生草本植物,是一种丰富的自然资源.芹菜含有多种化学成分,除了含有丰富的营养元素外,芹菜中还含有多种生理活性的物质,主要包括:黄酮类物质、挥发油化合物、不饱和脂肪酸、氨基酸、香豆素衍生物、叶绿素、膳食纤维等多种物质.祖国医学证明,芹菜性凉味甘、具有止血、平肝、祛风、利湿、镇静降压等功效,可治疗高血压、血管硬化、神经衰弱、咳嗽痰多、小便淋痛、黄疸等症[1].

目前,国内外对芹菜的研究主要集中在挥发油和黄酮类化学成分以及生理功能上[2].芹菜作为一种常食蔬菜,人们经常食用其茎而对芹菜叶没有进行充分的利用.本文测定了芹菜叶提取物在较佳提取工艺条件下的黄酮含量;此外分别用紫外可见光谱和荧光光谱研究了芹菜叶提取物对羟自由基的清除性能,以期为芹菜叶提取物的开发利用提供一些参考数据.

2 实验部分

2.1 仪器与材料

UV-2550紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司),FP-6000荧光光谱仪(日本Jisac公司)芹菜(杭州市市售)将芹菜叶洗净,自然风干数天,将其磨成细粉,密闭、避光储存,备用.芦丁(生化试剂),其它试剂均为分析纯.

2.2 方法与结果

2.2.1 提取条件的选择

[3],用控制变量法确定芹菜叶提取物的较佳提取工艺.变量分别为:提取剂(乙醇的体积分数)、提取时间、提取次数、料液比.通过采用清除羟自由基活性——Fenton实验,测定在510nm处的吸光度,得出芹叶提取物较佳提取工艺为:体积分数为85%的乙醇溶液,料液比为1∶18(质量比),室温普通震荡提取50min,提取3次.

2.2.2 提取液叶绿素的去除

取洁净的干燥管,少量棉花放入气泡下端,将活性碳装在干燥管中,将提取液从干燥管进口倒入,让其进行动态吸附,重复吸附3次即可以将叶绿素除去.将除去叶绿素的提取液转移到100mL的容量瓶中,用85%的乙醇溶液定容至刻度待用.

2.2.3 黄酮含量的测定

2.2.3.1 标准曲线的绘制

以芦丁为标准样品,采用亚硝酸钠-氯化铝比色法[4].先用芦丁对照品配制标准溶液,于510nm波长处测定吸光度.得回归方程:A=0.38238m-0.00392,相关系数r=0.9979.式中A为吸光度,m为芦丁的质量.铝盐络合分光光度法测定总黄酮的原理为:在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下,黄酮类化合物与铝盐生成螯合物,加入氢氧化钠溶液后显红色,在510nm波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律.

2.2.3.2 芹菜叶总黄酮含量的测定

称取1.6372g芹菜叶细粉,在2.2.1提取条件下提取,提取液定容至100mL.取10mL比色管7支,分别加入芹菜叶提取液2.0mL,50g/L NaNO21mL,摇匀,放置5min后加入62.5g/L AlCl31.0mL,摇匀,放置5min,再加入40g/L NaOH 10mL,加蒸馏水至刻度,混匀,15min后用分光光度计在最大吸收波长510nm处测定其吸光度,结果见表1.

表1 芹菜叶提取液总黄酮含量

表1数据表明:吸光度的重现性较好,用紫外分光光度法测芹菜叶提取物中黄酮类化合物的含量,标准偏差0.053和相对标准偏差为0.009均较小,所得数据准确可靠.将结果代入回归方程,得知芹菜叶总黄酮的含量为1.67mg/g.

2.2.4 Fenton-Fe2+-H2O2体系紫外光度法清除羟自由基实验

Fe2+-2H2O2体系通过芬顿(Fenton)反应产生羟自由基(·OH).反应原理如下:

邻二氮菲-Fe2+水溶液因被羟自由基氧化为邻二氮菲-Fe3+溶液,在510nm处的吸光度减小.加入H2O2前加入芹菜叶提取液,则Fenton反应产生的羟自由基被抑制或部分抑制,体系在510nm处的吸光度降低程度减小.

取10mL比色管,依次加入1.0mL pH=7.4的KH2PO4-NaOH溶液,0.30mL 7.5mmol/L硫酸亚铁铵溶液和0.30 mL 7.5 mmol/L邻二氮菲溶液,1号比色管中直接用蒸馏水定容至刻度;2号比色管加入0.20mL 7.5 mmol/L过氧化氢溶液后蒸馏水定容至刻度;3号比色管中分别加入芹菜叶提取物和过氧化氢溶液后用蒸馏水定容至刻度.在37℃水浴中放置1h,在最大吸收波长510nm下测吸光度,计算对羟自由基的清除率,结果见表2.从表2数据可以看出:芹菜叶提物对羟自由基有清除作用,随着提取液的用量增加,清除率也随着增大,当加入提取液增加到4mL后,清除率基本稳定下来,说明清除作用会达到饱和.参考文献[4],计算自由基清除率如下:自由基清除率(%)=(A3-A2)/(A1-A2)×100%.式中,A1和A2分别为体系不加过氧化氢和加过氧化氢时的吸光度,A3为加入芹菜叶提取液后的吸光度.

表2 芹菜叶提物对羟自由基的清除

2.2.5 罗丹明B-Mn2+-H2O2同步荧光光度法清除羟自由基实验

罗丹明B能产生特征荧光,弱碱性介质中Mn2+-2H2O2体系产生的羟自由基可迅速氧化罗丹明B使荧光猝灭,而加入芹菜叶提取液后可部分清除溶液中羟自由基,从而使其荧光猝灭程度减弱.

参考文献[5],在10mL比色管中,依次加入0.5mL 1×10-2g/L罗丹明B溶液,pH=9.0的氨水-NH4Cl缓冲溶液1.5mL,0.25mol/L的硫酸锰溶液0.50mL,0.6%(体积分数)过氧化氢溶液0.40mL,定容至刻度并摇匀;于40℃的水浴中放置15min,用冰水冷却3min.以Δ λ=21nm同步扫描,测定574nm波长处的荧光强度F,计算其与空白溶液(罗丹明B加缓冲溶液)荧光强度F0之差ΔF,通过测定ΔF变化,间接测定羟自由基的产生量.于试管中先加入一定量的羟自由基清除剂(芹菜叶提取液),再加入罗丹明B、pH=9.0的氨水-NH4Cl缓冲溶液、MnSO4溶液及过氧化氢,测定荧光强度Fs;罗丹明B加缓冲溶液作为空白参比,其荧光强度为F0;未加清除剂的体系其荧光强度为F.计算清除率,数据见表2及图1.

图1 同步荧光分光光度法清除羟自由基

表3 罗丹明B-Mn2+-2H2O2体系芹菜叶提取液对羟自由基的清除率

表3和图1表明:随着加入提取液量的增加,自由基的清除率也随着增大,说明芹菜叶提取液对羟自由基有较好的清除作用.

3 小 结

(1)在较佳提取条件下,芹菜提取液中的黄酮含量为1.67mg/g.

(2)紫外和荧光实验表明:芹菜叶提取物对羟自由基有很好的清除作用,羟自由基清除率最大分别可达81.69%和64.52%.

(3)从资源的综合利用考虑以及实验结果表明:芹菜叶提取物可以作为天然抗氧化剂加以开发利用.

参考文献:

[1]周辉,卢向阳.芹菜的化学成分和药理活性[J].氨基酸和生物资源,2006,28(1):6-8.

[2]闫向阳,杨喜平.芹菜黄酮提取及其对油脂抗氧化性研究[J].粮食与油脂,2006,24(4):24-26.

[3]朱妙琴,朱钱锋.植物超声提取物抗氧化成分的光谱分析比较[J].光谱实验室,2008,25(2):88-90.

[4]郭亚力,李聪,欧灵澄,等.3种分光光度法对天然抗氧化物质抗自由基性能的分析检测[J].分析试验室,2004,23(10):43-48.

[5]张爱梅,刘妮娜,臧运波,等.罗丹明B-Mn2+-2H2O2体系同步荧光分光光度法测定中药的抗氧化活性[J].理化检验-化学分册,2007,43(4):280-282.