N-十六烷基-羟乙基-二甲基溴化铵与牛血清白蛋白的结合作用

卢 伦,方 成,胡泽斌,沈颖颖,夏 署,邵 爽

(浙江外国语学院理工学院,浙江杭州310012)

表面活性剂与蛋白质相互作用在工业、生物、食品、医药和化妆品等行业中具有广泛的应用价值,因此一直备受关注[1-3].表面活性剂分子作为一种双亲分子,它能够和多肽以及蛋白质等大分子发生作用,致使蛋白质结构构象的稳定性、蛋白质分子表面的疏水性以及生物催化活性等发生变化,对其作用方式的研究可为许多科学研究建立理论基础[4].此外,表面活性剂还常用于细胞膜中蛋白质的提取,从仿生角度考虑,蛋白质和表面活性剂相互作用的研究可为了解蛋白质与类脂化合物或激素类小分子的结合提供有价值的模型.

牛血清白蛋白(BSA)是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质,能够储存和转运众多内源性和外源性化合物[5],因为其具有较为清楚的组成和结构且易于分离、提纯,常作为模型球蛋白用于研究蛋白质与金属离子、药物、染料和表面活性剂等的相互作用[6-9].蛋白质与表面活性剂相互作用的研究,涉及蛋白质与表面活性剂二者的作用机制、表面活性剂分子对蛋白质结构、构象及功能、聚集行为等的影响,在理论和实际应用方面都有十分重要的意义.

表面活性剂与蛋白质相互作用的实验研究方法比较多,如传统的表面张力法、电导法、电化学法和粘度法等,以及现代不断发展的光谱法、圆二色谱法、小角X射线散射法、电子自旋共振光谱法和量热法等[2-3,10-11].荧光法作为最常用的光谱方法之一,分析快捷、灵敏度高,该方法基于蛋白质中某些氨基酸残基周围微环境极性的变化引起荧光发射强度的改变,从而分析表面活性剂与蛋白的结合效率并监测蛋白质三维结构的变化.本文用荧光光谱法研究季铵盐表面活性剂N-十六烷基-羟乙基-二甲基溴化铵(CHDAB)与BSA的相互作用,并运用理论模型对实验数据处理得到猝灭常数、结合常数、平均结合位点数等重要结合作用参数,以阐明表面活性剂与BSA的结合机制及作用规律.

1 实验部分

1.1 仪 器

FP-6200型荧光分光光度计(日本,Jasco公司);Finnpipette移液器(上海雷勃分析仪器有限公司)5-50μL,20-200μL;TB-85型超级恒温器(日本,Shimadzu公司);UPWS-10T超纯水器(杭州永洁达净化科技有限公司);AB265-S电子分析天平(瑞典,METTER TOLEDO公司).

1.2 试 剂

牛血清白蛋白(BSA)购于上海伯奥生物科技有限公司,氮含量≥13.5%;N-十六烷基-羟乙基-二甲溴化铵(CHDAB)由浙江大学化学系提供(纯度≥99.9%);三羟基氨基甲烷(Tris)(纯度≥99.9%)、HCl(浓度为36%～38%)、NaCl(含量≥99.5%)均为分析纯;实验用水为超纯水器处理的超纯水.

配制pH=7.1的Tris-HCl缓冲溶液(内含0.1 mol·L-1的NaCl以维持离子强度);用上述Tris-HCl缓冲溶液分别配制以下溶液备用:4.0μmol·L-1,8.0μmol·L-1,12.0μmol·L-1,15.0μmol·L-1BSA溶液;2.5×10-2mol·L-1CHDAB溶液.

1.3 实验方法

BSA荧光激发和发射光谱的测定:移取一定浓度BSA溶液于石英比色皿中,设置发射波长为280nm,狭缝宽度为5nm,在298 K下扫描250～350 nm的荧光激发光谱,测得其最大激发波长;并在其最大激发波长处,同样条件下扫描其290～410nm的荧光发射光谱,得到最大发射波长.

用移液器分别移取一定量的上述CHDAB溶液与一定量不同浓度的BSA溶液于容量瓶中,配制成CHDAB-BSA系列混合溶液,静置、恒温(298K).分别测定其荧光光谱、同步荧光光谱.

2 结果与讨论

2.1 BSA的激发和发射光谱

由于BSA分子中色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)等氨基酸残基可吸收270～300 nm紫外光产生荧光,从而成为内源性荧光物质,其中最强的是Trp,其荧光最大激发波长在282 nm附近.

按上实验方法得到BSA的激发和发射光谱示于图1(298K,[BSA]=8μmol·L-1).实验得到在本实验条件下BSA的最大激发波长(λex)为282nm,在此激发波长下其最大发射波长(λem)为345nm.

2.2 CHDAB对BSA的猝灭光谱

荧光猝灭是指使因外加物质导致荧光物质荧光强度减小的过程.分子间相互作用能导致荧光猝灭,包括分子间的碰撞、激发态与基态分子之间的反应、分子重排、能量转移以及形成基态复合物等.其猝灭机理通常划分为两类:静态猝灭和动态猝灭.静态猝灭主要是由于基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合生成复合物所致[12];动态猝灭则是由于激发态荧光分子与猝灭剂碰撞所致.

按照上述实验方法,在最大激发波长(282 nm)下,固定BSA浓度,逐渐增大表面活性剂的浓度,测得298 K时CHDAB与BSA的荧光猝灭光谱.图2示出CHDAB对BSA(8.0μmol/L)的荧光猝灭光谱及对BSA最大发射波长的影响.

由图2(a)可得,在实验条件下,随着CHDAB浓度增加,首先BSA的荧光强度逐渐减小,呈现规律性猝灭,但在CHDAB高浓度(＞250μmol·L-1)时荧光强度又呈现增大趋势.298K时CHDAB的临界胶束浓度(CMC)为840μmol·L-1[13],一般说来,在浓度低于其CMC时,阳离子型表面活性剂是BSA的猝灭剂[14],本实验得到类似结果.

由图2(b)可看出,随着CHDAB浓度的增加,BSA的最大发射波长发生明显蓝移(从345nm蓝移到332nm).这是由于随着表面活性剂的加入,BSA结构发生解折叠,Trp逐步暴露到表面,与表面活性剂分子发生作用,Trp周围的微环境发生了变化,疏水性增强所致[17].

2.3 BSA浓度对荧光猝灭的影响

图3示出CHDAB对不同浓度(4.0,8.0,12.0,16.0μmol/L)BSA的荧光猝灭情况.

此实验结果表明,CHDAB对BSA的荧光猝灭效应与BSA浓度有关:BSA浓度越小,表面活性剂对其的猝灭效应越强.在本实验浓度范围内,对于[BSA]为4.0,8.0μmol/L体系,I0/I随[CHDAB]增大先增大,出现极大值点,然后开始减小;对于BSA浓度高(12.0,16.0μmol/L)体系,I0/I随[CHDAB]增大先增大,然后出现拐点,进一步出现平台.

上述实验现象反映了CHDAB与BSA的结合过程,[CHDAB]/[BSA]值越大,其对BSA的猝灭作用越强,二者的结合作用越大,较易达到完全或饱和,其特征为I0/I-[CHDAB]曲线出现极大值或平台.

2.4 Stern-Volmer猝灭常数

对于低浓度区,CHDAB对BSA荧光猝灭较好符合Stern-Vo lmer方程[16]:

图3 CHDAB对不同浓度BSA的荧光猝灭(T=298K)

式中I0为未加入猝灭剂(表面活性剂)时荧光分子(BSA)的荧光强度;I为猝灭剂浓度等于[D]时荧光分子的荧光强度,Kq为双分子猝灭过程的速率常数,τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命(生物大分子的τ0约为10-8s),Ksv称为Stern-Volmer猝灭常数.表1列出了[CHDAB]低于90μmol/L时,按式(1)拟合得到不同BS A浓度时体系的Stern-Vo lmer猝灭常数Ksv、相关系数R2及计算得到的Kq.

表1 不同BSA浓度时体系的Stern-Vo lmer猝灭常数KSV及Kq,R2值

猝灭常数Ksv在一定程度上反映了CHDAB与BSA结合作用的大小.从表1可以看出,相同温度下,随着BSA浓度增大,Ksv减小,这主要是因为表面活性剂CHDAB与BSA结合时,其单体有一个重新分布到蛋白质分子可键合位点的过程,但不与色氨酸残基(Trp)发生作用,BSA浓度的增大,对表面活性剂相当于起到一个“稀释作用”,从而导致Ksv减小[17].

本实验得到不同BSA浓度体系的双分子猝灭速率常数Kq均大于生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数(2.0×1010L·mol-1·s-1),这是CHDAB对BSA的荧光猝灭呈现静态猝灭机制特征的实验佐证之一.

2.5 位点结合模型及处理

对于静态猝灭,可以用如下的位点模型来计算二者结合常数KA和结合位点数n[18]:

将实验所得数据将lg[(I0-I)/I]对lg[D]进行线性回归,得到CHDAB与不同浓度BSA的结合常数KA、结合位点数n及相关系数R2列于表2.

表2 CHDAB与BSA的结合常数KA、结合位点数n及相关系数R2

从表2可以看出,CHDAB与BSA间存在一定的结合作用,结合常数在103(L·mol-1)数量级,且基本上为单位点结合.BSA浓度增大,结合常数KA减小,这也可以归结为“稀释作用”.

2.6 CHDAB对BSA构象的影响

固定激发波长与发射波长间距Δ λ,同步扫描可得同步荧光光谱,这种光谱可用于蛋白质构象变化的分析[19].由Δ λ=20nm所得到的同步荧光谱图仅显示蛋白质酪氨酸残基的光谱特征,而由△λ=60nm所得到的同步荧光谱图仅表现出色氨酸残基的光谱特征.

BSA浓度保持恒定,逐渐增加CHDAB的浓度,绘制BSA的同步荧光光谱.图3中的a和b分别为BSA中酪氨酸和色氨酸残基的同步荧光光谱图.-1-1

图3 BSA同步荧光光谱图

由图3可以看出,随CHDAB浓度的增大,酪氨酸残基和色氨酸残基的最大发射波长均发生了变化,表明酪氨酸、色氨酸残基所处的环境都发生了略微改变,即CHDAB的加入导致BSA的构象发生了微弱的变化.

3 结 论

3.1 测定了pH为7.1的Tris-HCl缓冲溶液(内含0.1 mo·lL-1的NaCl)中季铵盐类表面活性剂CHDAB对BSA的猝灭光谱,结果表明CHDAB对BSA有荧光猝灭作用,并且导致最大发射波长蓝移.

3.2 用Stern-Volmer方程和位点模型分别考察了低浓度时二者的结合参数.结果表明CHDAB对BSA的猝灭效应与BSA的浓度有关——在相同温度下,BSA浓度越小,其Stern-Vo lmer常数Ksv和结合常数KA越大,猝灭效应越强.

3.3 测定了CHDAB对BSA的同步荧光光谱,结果表明CHDAB对BSA的构象有一定影响.

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