茄蒂黄酮提取工艺及抗氧化性研究

2011-01-25安红钢林敏任雪峰于文广吴冬青

中成药 2011年11期

安红钢，林敏，任雪峰，于文广，吴冬青

(河西学院化学化工学院，甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃张掖734000)

茄子Solanum melongena L.是一年生草本植物，亚洲、地中海、中欧及东南欧地区广泛栽培的蔬菜作物［1］。茄子是我国普遍食用的蔬菜，价格低廉，容易取材，而茄蒂(茄子的萼片)常作为茄子的下脚料丢弃。茄子全身均可入药，茄蒂可治风下血不止、血痔、口齿疮、癜风等［2］。本实验以茄蒂黄酮为主要指标，在单因素试验基础上，借助SAS9.2统计分析软件，采用响应曲面法的Box-Behnken设计优化出茄蒂黄酮最佳提取工艺。又通过体外实验进行抗氧化作用研究，并应用Origin分析软件对实验数据进行线性回归，计算清除自由基的IC50和还原力的IC0.5。研究结果以期为该植物资源的充分利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

茄子(张掖市产紫黑色长茄子)购于蔬菜市场，取下茄蒂，洗净、晾干，粉碎备用。

DPPH Sigma公司;邻二氮菲、双氧水、硫酸亚铁、三氯乙酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、三氯化铁等均为分析纯。实验用水为二次水。

WFJ2100型可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司);RE-52旋转蒸发器(上海青浦泸西仪器厂);SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);国华HH-6数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 茄蒂黄酮提取工艺

1.2.1.1 提取工艺流程茄蒂→洗净→晾干→粉碎→加入乙醇→浸泡1 h→超声→抽滤→减压浓缩→定容→得黄酮备用液

1.2.1.2 黄酮含量测定［3］准确移取浓度为0.24 mg/mL芦丁标准溶液0、0.20、0.60、1.20、1.80、2.40 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入5%NaNO20.5 mL，摇匀，放置5 min后，加入10%Al(NO3)30.5 mL，摇匀，再放置5 min，然后加4%NaOH溶液5 mL，补水至刻度，放置1 min后，在510 nm处测定吸光度(以试剂空白为参比)，以样品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，得回归直线方程:y=0.303 4x+0.010 7(R2=0.999 5)。线性范围0～0.9 mg。

1.2.1.3 单因素试验考察料液比、乙醇浓度、超声时间3个因素对茄蒂黄酮提取量的影响。

1.2.1.4 响应面法试验设计［4-5］在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选取料液比、乙醇浓度、超声时间为试验因素，以茄蒂黄酮含量为响应值，设计了三因素三水平的响应面分析试验，见表1。

表1 响应面法试验的因素水平Tab.1 The factor and level of response surface test

1.2.2 体外抗氧化作用研究

1.2.2.1 清除·OH自由基的测定方法采用邻二氮菲-Fe2+-H2O2法测定［6-7］，并有所改动。实验设五组:空白组、未损伤组、损伤组、样参组、样品组。测定波长为510 nm，按表2加样。对照品为Vc、槲皮素、芦丁(以下试验相同)。

表2 邻二氮菲-Fe2+-H2O2法各试剂组成(mL)Tab.2 Composition of reagent systems for phenanthroline-Fe2+-H2O2reaction

1.2.2.2 清除O－2·自由基的实验方法采用邻苯三酚自氧化法测定［8-10］，方法有所改动。取3.00 mL，pH 8.2，50 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，加入0.5 mL不同浓度样品溶液，混合后在25℃水浴中预热10 min，然后立即加入25℃预热过的50 mmol/L邻苯三酚0.5 mL，迅速摇匀，25℃下反应3 min(加入邻苯三酚开始计时)后。10 min后，在420 nm处每隔1 min测定吸光度。以等体积10 mmol/L HCl代替邻苯三酚为空白调零，对照以等体积二次水代替样品。

式中:A0为对照OD值;A为样品OD值。

1.2.2.3 清除DPPH自由基的实验方法［11-12］准确移取4 mL不同浓度样品溶液，加入0.065 mmol/L DPPH乙醇溶液4 mL，摇匀，常温反应30 min后于517 nm处测定吸光度A1;同上法，95%乙醇代替DPPH溶液，测定吸光度A2;同上法，二次水代替样品液，测定吸光度A。

1.2.2.4 还原力测定方法采用普鲁士蓝法［11］。移取3.00 mL不同浓度样品溶液，分别加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液和1%的K3Fe(CN)6溶液各2.50 mL并混合均匀，混合液在50℃保温20 min后加入2.50 mL 10%的三氯乙酸溶液，混合后离心(3 000 r/min)10 min。取上清液2.50 mL，加入2.50 mL二次水及0.50 mL 0.1%FeCl3溶液，混匀，静止10 min，测定其在700 nm处的吸光度值。用吸光度值表示还原力，吸光度值越大，表明还原力越强。

2 结果与分析

2.1 最佳提取工艺确定

2.1.1 响应面试验与分析

根据Box-Behnken设计模型，按表1以料液比、乙醇浓度、超声时间为自变量，以茄蒂黄酮产量为响应值，试验结果见表3。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Tab.3 Box-Behnken experimental design and results

采用SAS9.2统计分析软件对表3数据进行多元回归分析，结果各试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，试验因子对响应值影响的回归方程为:Y=37.17+1.059X1+2.455X2－1.782－1.350XX－4.390－1.393X2X3－2.463X32

方差分析结果见表4。试验所得的二次多项模型表现极其显著(P＜0.001)，决定系数为R2=98.22%，说明回归方程的拟合程度很好，失拟较小，回归方程能很好地反映各因子与响应值的关系，可预测茄蒂黄酮实际产量。从表4中的P值又可知，方程中X1、X2、、X1X3、、X2X3、对Y值的影响显著，对黄酮产量影响大小排序为:乙醇浓度＞料液比＞提取时间。

为确定各因素的最佳取值，利用SAS9.2软件进行岭脊分析，得出回归模型响应值Y的最大估计值为37.68 mg/g，其对应的茄蒂黄酮提取的最佳条件为:料液比1∶26(g/mL)，乙醇质量分数73%，超声时间30 min。

2.1.2 提取工艺优化验证实验

在以上优化条件下进行3次验证实验，得出茄蒂黄酮平均提取量为37.09 mg/g(37.01、37.12、37.15 mg/g)，与预测值接近。说明该方程与实验情况拟合很好，响应面对茄蒂黄酮提取条件的优化是可行的。

2.2 茄蒂提取物抗氧化能力

2.2.1 对·OH自由基的清除能力

按茄蒂黄酮最佳提取条件提取3批次，提取液合并，定容，然后配制不同浓度黄酮溶液，考察茄蒂黄酮溶液抗氧化能力。按方法1.2.2.1项测定样品在510 nm处吸光度值，代入清除率d的计算公式，结果见图1。

图1 乙醇提取物对·OH清除作用Fig.1 Scavenging effect of ethanol extracts on·OH radical

由图1可知，样品液与对照品羟自由基的清除率随浓度增大而增大，样品中黄酮浓度在0.2～1.4 mg/mL范围内液清除率高于芦丁，与Vc和槲皮素相近。当样品中黄酮质量浓度为大于1.4 mg/mL时，样品清除率达到了96.70%。由Origin分析软件对实验结果线性回归，相关系数在P＜0.001水平时都在R2＞0.92。计算得样品、Vc、槲皮素和芦丁的IC50值分别为0.47、0.66、0.68和0.99 mg/mL。由IC50值判断清除羟自由基能力依次为:样品＞Vc＞槲皮素＞芦丁。

表4 回归方程方差分析结果Tab.4 The variance analysis results of regression equation

2.2.2 对O－2·自由基的清除能力

邻苯三酚自氧化过程中，在400～420 nm处会形成有光吸收的中间物，抗氧化剂抑制作用越强中间产物会越少，则吸光度值越低［8］。本试验测定420 nm处吸光度，并计算其清除率。见图2。

图2 乙醇提取物对·清除作用Fig.2 Scavenging effect of ethanol extracts on·radical

2.2.3 对DPPH·自由基的清除能力

DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，DPPH自由基乙醇溶液为深紫色，则在517 nm处有最大吸收峰。见图3。当有自由基清除剂存在时，DPPH自由基接受清除剂电子，而使氮原子上单电子配对呈现抗磁性，使溶液颜色变淡，吸光度值变小［13］。

图3 乙醇提取物对DPPH清除作用Fig.3 Scavenging effect of ethanol extracts on DPPH radical

图3可看出，各溶液清除率与浓度呈正相关，在测定范围内，Vc清除率最显著，样品液次之，槲皮素与芦丁交差上升。试验结果进行线性回归计算得样品黄酮、Vc、槲皮素和芦丁的IC50值分别为0.068、0.058、0.1和0.095 mg/mL。在P＜0.001时，4个试验品的相关系数均＞0.94。由IC50值确定的清除率大小依次为:Vc＞样品＞芦丁＞槲皮素。

2.2.4 提取物还原能力

如果物质是电子给予体，它可将Fe(CN)63－还原成Fe(CN)64－，便与Fe3+形成普鲁士蓝，其在700 nm处有最大吸收峰。根据吸光度值大小可确定还原能力强弱，吸光度越大，抗氧化能力越强。见图4。

图4 乙醇提取物还原力Fig.4 The reduction energy of the ethanol extracts

从图4可以看出，样品液还原能力弱于Vc和槲皮素，远远强于芦丁。实验结果线性回归，得芦丁、槲皮素、Vc、样品相关系数分别为:R2=0.868 8(P＜0.01)、R2=0.939 7(P＜0.001)、R2=0.997 7(P＜0.000 1)、R2=0.984 8(P＜0.000 1)。经计算IC0.5值(吸光度值为0.5时，所需各试验品量)分别为:样品黄酮质量浓度0.60 mg/mL、Vc 0.48 mg/mL、槲皮素0.53 mg/mL和芦丁1.29 mg/mL，还原能力依次为:Vc＞槲皮素＞样品＞芦丁，样品具有较强的还原能力。

3 结论

3.1 响应面分析法优化茄蒂黄酮提取工艺试验结果表明，黄酮的最佳提取工艺参数为:料液比1∶26(g/mL)，乙醇73%，超声时间30 min，黄酮实际提取量为37.09 mg/g，与模型预测值接近，说明实验方法合理可行，可以用回归方程预测茄蒂黄酮实际产量。

3.2 实验采用几种体外抗氧化实验模型研究了茄蒂提取物的抗氧化能力，通过这些实验模型证明了茄蒂提取物具有较强的清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基能力和还原力。由清除率的IC50值和还原力的IC0.5值，确定清除·OH自由基次序为:样品＞Vc＞槲皮素＞芦丁;清除O－2·自由基次序为:Vc＞样品＞芦丁＞槲皮素;清除DPPH自由基的IC50值次序为Vc＞样品＞芦丁＞槲皮素;还原力为:Vc＞槲皮素＞样品＞芦丁。茄蒂提取物清除·OH、O－2·、DPPH·的IC50值分别为0.47、0.58、0.068 mg/mL，相比之下提取液对DPPH·清除作用最为显著。还原力的IC0.5值为0.60 mg/mL。结果表明，茄蒂提取物具有良好的体外抗氧化作用，作为天然抗氧化剂具有很好开发利用价值。

［1］魏小伞，曹必好，雷建军，等.茄子抗病育种研究进展［J］.中国蔬菜，2010，5(10):1-18.

［2］谢宇.本草纲目菜部妙用［M］.北京:军事医学科学出版社，2009，101-103.

［3］吴冬青，安红钢，齐亚娥，等.九种药用植物花黄酮类物质提取及对羟自由基清除能力的研究［J］.天然产物研究与开发，2008，260(3):514-517.

［4］刘军海，黄宝旭，蒋德超.响应面分析法优化艾叶多糖提取工艺研究［J］.食品科学，2009，30(2):114-118.

［5］沈霞，张艳红，袁慧慧，等.响应面分析法优化艾叶粗多糖提取工艺的研究［J］.中成药，2010，32(1):48-51.

［6］盛伟，方晓阳，吴萍.白灵茹、杏鲍茹、阿魏茹多糖体外抗氧化活性研究［J］.食品工业科技，2008，29(5):103-109.

［7］乌兰格日乐，白海泉，翁慧，等.广霍香多糖的优化提取工艺及抗氧化作用［J］.中成药，2010，32(7):1246-1248.

［8］沈玥，张永忠.红三叶草异黄酮抗氧化活性的研究［J］.食品与发酵工业，2009，35(11):122-124.

［9］王桃花，王莹，钱玮，等.大豆荚壳异黄酮制备与体外抗氧化性研究［J］.大豆科学，2009，28(5):913-916.

［10］谢辉，陈双林.杜仲内生球毛壳菌的抗氧化活性研究［J］.菌物学报，2009，28(4):591-596.

［11］姚亚平，曹炜，陈卫军，等.花生壳水溶性膳食纤维不同提取工艺及其抗氧化活性研究［J］.食品科学，2006，30(22):27-32.

［12］莫正昌，邓靖，汲广全，等.鹿蹄草提取物体外抗氧化活性评价［J］.食品科学，2010，31(3):19-21.