基于谱效相关的多指标综合加权评分法优选生地黄的提取工艺
2011-01-25郭东艳张丽娟师延琼王梅
郭东艳,张丽娟,师延琼,王梅
(1.陕西中医学院药学院陕西咸阳712046;2.陕西中医学院附属医院制剂中心陕西咸阳712000)
生地黄汤来源于《千金方》,由生地黄和大黄两味药组成,用法:生地黄煎汁,生大黄为沫冲服[1]。依据临床应用与生地黄止血作用的活性部位[2-3],有必要对生地黄的提取工艺进行相关研究,同时根据其止血作用活性部位的筛选,考虑到活性部位主要为一些极性较大的部位[4-5],因此拟选择以水作为提取溶媒,并针对影响水提的主要因素药材加水量、浸泡时间及煎煮时间3个因素,采用正交实验设计,以样品中多糖量、各指纹峰相对于梓醇量的加和为评价指标进行综合评分[6-11],优选最佳提取工艺。
1 仪器与试药
1.1 仪器Waters高效液相色谱仪(Waters2695 Separations Module,Waters2996 DAD检测器)含在线真空脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱。可见—紫外分光光度仪(UV-1102,上海天美科学仪器有限公司)。
1.2 药品与试剂生地黄(西安盛兴中药饮片有限责任公司,批号:090701,经陕西中医学院生药教研室王继涛老师鉴定为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根);95%乙醇(安徽安特生物化学有限责任公司,分析纯);浓硫酸(西安三浦精细化工厂,批号:081020);蒽酮(国药集团化学试剂有限公司,批号:Lot.NO20061108);梓醇对照品(批号110808-200407,供定量测定用,中国药品生物制品检定所);乙腈为色谱纯;水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2.1 评价指标的测定
2.1.1 多糖量测定[2]供试品溶液的制备将单因素实验1~4号样品及正交实验1~9号样品,分别加95%乙醇使含醇量达到80%,加盖放置24 h。保留上清液。将醇沉淀物加水溶解,至50 mL量瓶。将各样品分别在622 nm下测定吸光度,计算多糖量。
2.1.2 样品中各指纹峰相对于梓醇量的测定
2.1.2.1 色谱条件与系统适用性色谱柱:Akasil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:乙腈(A)-水(B)梯度洗脱,0~5 min A由0.3%升至1%,5~10 min 1%升至2.6%,10 min~16 min 2.6%,16~32 min A由2.6%升至8%,32~40 min A由8%升至15%,40 min~60 min A由15%升至30%;检测波长为210 nm;柱温:30℃;体积流量:1 mL/min。
2.1.2.2 对照品溶液的制备精密称取梓醇对照品适量,加流动相制成每1 mL约含0.28 mg的溶液,摇匀,即得。
2.1.2.3 供试品溶液的制备用2.1.1项供试品溶液制备中的上清液,回收乙醇至无醇味,蒸干,用水定容于50 mL量瓶,取3 mL水浴蒸干,加流动相定容于10 mL量瓶。0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
2.1.2.4 指纹峰定量分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL,注入液相色谱仪进行测定,选择保留时间固定,达到基线分离的指纹峰,记录峰面积,以基准峰梓醇为依据,计算每个指纹峰的相对含量。样品指纹图谱见图1。
图1 样品的HPLC指纹图谱
2.2 单因素试验考察生地黄的提取次数样品溶液的制备:称取生地黄药材约50 g,加8倍量水,浸泡30 min,分别提取1次,2次,3次,4次,每次1 h。以样品中多糖量、各指纹峰相对于梓醇量的加和为评价指标筛选提取次数,结果见表1。
从表1中可以看出,提取1次,2次,3次时多糖量及各指纹峰相对梓醇量增加较大,提取4次时多糖量及各指纹峰相对梓醇量增加不大,表明已基本完全,因此确定提取次数为3次。
2.3 正交试验设计根据单因素预实验结果,结合水提工艺的主要影响因素药材浸泡时间、加水量、提取时间3个因素,每个因素选择3个水平,按照L9(34)正交表进行设计。以样品中多糖量、各指纹峰相对于梓醇量的加和为评价指标筛选最佳提取工艺参数。因素水平见表2。
表1 单因素筛选实验结果
表2 正交实验因素水平表
2.3.1 正交试验样品溶液制备称取生地黄药材共9份,每份约50 g,按表3中L9(34)正交实验设计的方案进行加水,浸泡,煎煮提取,提取液滤过,浓缩至50 mL,即得各样品液。
2.3.2 正交实验结果根据生地黄止血作用的药效学实验结果,得出其有效部位可能是糖类、环烯醚萜苷类,故选择多糖量、样品中各指纹峰相对于梓醇量的加和为评价指标,进行综合评价分析。根据各指标对提取工艺影响的贡献大小给予不同的权重系数,即多糖的量为0.4,样品中指纹峰相对于梓醇量的加和为0.6,进行加权求和,结果见表3。方差分析见表4。
2.3.3 结果分析以综合评分为考察指标,由表3中极差R值大小显示,各因素的作用主次为B(加水量)>C(提取时间)>A(药材浸泡时间)。表4方差分析结果表明:B因素各水平之间差异具有显著性(P<0.05),A、C因素各水平之间差异无显著性(P>0.05),综上所述最终提取工艺确定为:A2B3C3,即煎煮3次,用12倍量水,药材浸泡30 min,每次1.5 h。
2.4 验证试验称取生地黄药材共3份,每份约50 g,以单因素及正交试验筛选的结果进行提取,提取液滤过,浓缩至50 mL,即得样品液,测定样品中多糖质量、各指纹峰相对于梓醇的量,结果见表5。
3 讨论
随着科学技术的不断进步,多学科研究方法的不断融合,使得对复方的研究不再停留于药味的化学成分上,而是将化学研究和药理研究相结合。经药理研究得到有效部位,对有效部位再进行化学研究,这样才能做到基本讲清中药复方的化学成分,基本讲清中药复方的药效和作用机理[12]。优选提取工艺的目的是将发挥药效的部位得到最大程度的提取。在本实验中我们采用了药理研究与化学研究相结合的方法,在数据分析中时,采用多指标进行综合评价分析,其结果较单一指标的评价更为科学合理。根据这一思路,我们在充分尊重古方临床应用的基础上,对生地黄提取工艺的评价指标进行了探索。首先,王梅等[2]和张丽娟等[3]发现生地黄汤的有效部位为多糖,故选择多糖量为评价指标;其次,为了有效表征生地黄,我们选择了样品指纹图谱中保留时间固定、分离度较好的数种有效成分,对这些特征成分进行定量分析,但又因缺乏对照品,故选择了各指纹峰相对于梓醇的含量作为另一评价指标,从而优化筛选出生地黄的提取工艺,为该产品的工业化生产提供了一定的参考。
表3 正交试验设计与结果
表4 正交实验方差分析表
表5 验证试验结果
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[3]张丽娟,李瑾,王梅,等.生地黄汤不同配伍多糖含量变化及止血作用的实验研究[J].医学研究杂志,2010,39(11):41-43.
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