木香马兜铃与七味红花殊胜丸中马兜铃酸A测定研究

魏玉海， 王慧春， 刘亚蓉， 刘海青， 韩晓萍， 宋 霞

(青海省药品检验所，青海西宁810016)

七味红花殊胜丸为藏医传统名方，藏文名“苦空确屯日布”，由红花、天竺黄、獐牙菜、诃子、麻黄、木香马兜铃、五脉绿绒蒿七味藏药材组成。具有清热消炎、保肝退黄。用于新旧肝病，劳伤引起的肝血增盛，肝肿大，巩膜黄染，食欲不振［1-2］。木香马兜铃为马兜铃科植物木香马兜铃Aristolochia moupinensis Franch.的干燥茎及根茎［3-5］。陈娅娟等［6］、周娜等［7］、姚冬琴等［8］均分别报道了马兜铃酸A的肾毒性及其机制，因此有必要对含马兜铃酸A的木香马兜铃及其制剂七味红花殊胜丸中的马兜铃酸A量进行测定。本实验建立了测定七味红花殊胜丸及木香马兜铃中马兜铃酸A的测定方法，该方法能够准确的测定木香马兜铃与七味红花殊胜丸中马兜铃酸A。

1 仪器与试药

Waters2695型高效液相色谱仪，Waters2998二极管阵列检测器，Empower化学工作站(美国Waters公司);电子天平(METTLER AB204-S，瑞士 METTLER公司);电子天平(METTLER TOLEDO，瑞士METTLER公司);超声波清洗器(B2500s-MT，上海必能信超声波清洗仪有限公司)。

马兜铃酸A对照品(110746-200204)购自中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。七味红花殊胜丸样品、木香马兜及处方中相应药材由两家不同药厂提供，5批七味红花殊胜丸批号分别为:06343A、09177A、090401、090701、100501。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Sunfire-ODS C18柱(5 μm，250 mm × 4.6 mm);柱温30℃室温;流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液(45∶55)(按此比例混合后pH大于3);体积流量1 mL/min;检测波长为322 nm。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取马兜铃酸A对照品7.40 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，取2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度摇匀，即得，马兜铃酸A对照品溶液质量浓度为14.8 μg/mL。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 七味红花殊胜丸供试品溶液制备 取本品中粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，摇匀，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)40 min，取出，过滤，同时用少量70%甲醇冲洗药渣，并入滤液，滤液蒸干，残渣加25 mL水使溶解，水液用6 mol/L盐酸调pH值至1，用三氯甲烷萃取4次(每次20 mL)，合并三氯甲烷，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 木香马兜铃供试品溶液制备 取本品中粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，摇匀，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)40 min，取出，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例称取除去木香马兜铃药材的其他药材适量，依照上述供试品溶液的制备方法，制成阴性对照溶液。

2.5 系统适应性试验 在上述色谱条件下，精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应保留时间上，有相同的色谱峰，而阴性对照在此无干扰，阴性色谱图见图1。

2.6 马兜铃酸A峰的证明 为进一步证明供试品中所检测的色谱峰为马兜铃酸A的色谱峰，在提取色谱峰的同时，用二极管阵列检测器同时进行了光谱扫描，结果对照品与供试品相同的保留时间主峰的最大吸收分别均为:225、249、322、394 nm，而在与对照品与供试品相同保留时间的主峰处及前后均无相应光谱图，证明了样品中所测得主峰为马兜铃酸A的峰。

图1 阴性对照、对照品、样品HPLC色谱图

2.7 线性关系考察 按上述色谱条件，分别将上述马兜铃酸 A 对照品溶液(14.8 μg/mL)，稀释成 0.74、2.96、5.92、8.88、11.84、14.8 μg/mL 的溶液，分别精密吸取各对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，马兜铃酸A对照品进样量(X)为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程:Y=5.02×106×X -368×10，r=0.9999。试验结果表明在 0.0148 μg ～0.294 μg 的范围内，马兜铃酸A进样量与峰面积值呈良好的线性关系。

2.8 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液(14.8 μg/mL)，连续进样6次，每次进样体积为10 μL，测得马兜铃酸A峰面积RSD为0.26%。结果表明精密度良好。

2.9 稳定性试验 取批号为06343A的七味红花殊胜丸样品，按供试品制备项下的方法制成供试品溶液，按上述色谱条件分别于 0，2，4，6，8，12 h 注入液相色谱仪，每次进样体积为10 μL，测定峰面积，按马兜铃酸 A峰面积计算RSD为1.2%(n=6)。结果表明:供试品中马兜铃酸A在12 h内稳定性良好。

2.10 重复性试验 取批号为06343A的七味红花殊胜丸样品5份，按供试品制备项下的方法制成供试品溶液，每份样品进2针，每次进样体积为10 μL，在上述色谱条件下，测定马兜铃酸A，按马兜铃酸A峰面积计算RSD为1.1%(n=6)。结果表明供试品重现性良好。

2.11 加样回收率试验 取已知马兜铃酸A量样品(批号06343A，0.3848 mg/g)0.5 g，精密称定共 9 份，平均分为 3组，依次加入马兜铃酸A对照品溶液(0.074 mg/mL)2 mL、2.5 mL、3 mL，按供试品溶液方法制成所需溶液。依法测定，计算收率。结果见表1，回收率为98.9%，RSD为1.0%。

表1 回收率试验结果

2.12 样品测定 分别取七味红花殊胜丸与木香马兜铃药材，按照上述2.3项下七味红花殊胜丸与木香马兜铃供试品溶液的制备方法，分别制备七味红花殊胜丸与木香马兜铃的供试品溶液，并按上述2.1项下色谱条件进行测定，测得两批次木香马兜铃药材(样品1、样品2)及5批次七味红花殊胜丸(06343A、09177A、090401、090701、100501)中马兜铃酸A量结果见表2。

表2 木香马兜铃与七味红花殊胜丸中马兜铃酸A

3 讨论

3.1 检测波长的选择 以二极管阵列检测器对马兜铃酸A(质量浓度为0.0148 mg/mL)在200～400 nm进行紫外扫描，在225、249、322、394 nm处分别均有最大吸收，通过试验发现225 nm处为末端吸收，因此在色谱图上反应出杂质峰面积较高，在394 nm长波长处，选择394 nm的为检测波长时测得马兜铃酸A主峰面积有所降低，参考文献［9-10］及实际测得色谱峰情况，认为在选择322 nm波长为检测波长为最适条件，不过以225、249、394 nm为检测波长时也可以进行测定。

3.2 流动相的选择 分别考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸溶液、甲醇0.05%磷酸溶液，结果用乙腈 -0.05%磷酸溶液(45 ∶55)时的分离效果良好［11-13］，0.05%磷酸溶液pH约为2.5，当与乙腈按上述比例混合后，pH大于3，对普通色谱柱有较好耐用性。

3.3 供试品提取方式的选择 在供试品的提取过程中选择了回流、超声、索氏提取的方法，结果对于七味红花殊胜丸供试品溶液制备在超声处理后，用三氯甲烷从酸水液中提取，所得样品回收率高，且杂质无干扰［11-14］;对于木香马兜铃供试品溶液制备经过超声处理便可进样，分离良好，杂质峰无干扰。

3.4 5批次七味红花殊胜丸马兜铃酸A的平均质量分数为0.03%，两批木香马兜铃药材中平均质量分数为1.13%。谭睿等测得二十五味松石胶囊中马兜铃酸A平均质量分数为0.03 μg/g［9］，陈燕等测得二十五味绿绒蒿丸中马兜铃酸 A平均质量分数为 0.11 mg/丸［10］。英锡相等［15］、周跃华等［16］、韩娜等［17］、刘丽芳等［18］等均测定了部分含马兜铃酸A 的药材及成药，而谭睿等［9］、陈燕等［10］测定了含木香马兜铃药材成药中的马兜铃酸A，但均未见直接测定木香马兜铃药材中马兜铃酸A的报道。《中国药典》2010年版一部细辛中所含马兜铃酸A质量分数限度为不得过0.001%［11］，我们所测成药与药材中的马兜铃酸A均高于此限度。根据文献报道与本实验中测得的部分含木香马兜铃的藏成药中马兜铃酸A的含量比较高，考虑到马兜铃酸A的肾毒性，在临床使用含木香马兜铃药材成药过程中，长期服用或不同年龄阶段的患者要慎重服用，对于藏成药中马兜铃酸A的含有量较高的，考虑替换处方中木香马兜铃药材。

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