牛CTSB基因第6内含子SNP与经济性状的关联分析

邓桂馨，许尚忠，高 雪，李俊雅，高会江，袁峥嵘，周正奎，黄 萌，李 姣

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100094）

牛CTSB基因第6内含子SNP与经济性状的关联分析

邓桂馨，许尚忠，高 雪，李俊雅，高会江，袁峥嵘，周正奎，黄 萌，李 姣

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100094）

以174头西门塔尔牛和鲁西黄牛的杂交后代作为试验动物，利用PCR-RFLP方法对组织蛋白酶B基因（cathepsin B，CTSB）内含子6进行多态性检测，并应用SAS软件采用最小二乘法拟合线性模型，对不同基因型与牛部分经济性状进行关联分析。结果表明，CTSB基因内含子6的T5357C位点与大理石纹和活重2个经济性状显著相关，其中AA型大理石纹评分显著地高于BB型（P＜0.05），BB型活重显著高于AA型（P＜0.05）。上述结果为T5357C作为肉牛部分经济性状的分子标记提供了一定的理论依据。

牛；CTSB基因；肉质性状；胴体性状

为满足市场对高档牛肉消费需求的持续增长，加快肉牛育种业的发展，经济性状的分子标记辅助选择技术日益得到广泛应用。溶酶体组织蛋白酶（lysosomes cathepsin）家族基因是胴体和肉质性状研究的热点之一。组织蛋白酶 B、C、K、L、M、N和S等属于半胱氨酸蛋白酶;组织蛋白酶A、G和R属于丝氨酸蛋白酶;组织蛋白酶D和E属于天冬氨酸蛋白酶［1］，其中组织蛋白酶B和酶D、H及L是引起宰后肌肉降解的主要酶类［2］。组织蛋白酶B是目前研究最多，了解最透彻的溶酶体硫醇蛋白酶。该酶最早分别是从鲤鱼、灰鲻鱼、罗非鱼和鲭鱼中提纯得到的，分子量23～29 kDa。研究表明，鲤鱼组织蛋白酶B能降解肌肉肌球蛋白重链、肌动蛋白和肌钙蛋白T（TN-T），但对原肌球蛋白不起作用。此后，在20世纪70年代，鼠CTSB基因的结构得到了鉴定。比较研究发现，不同种动物的CTSB基因的结构非常相似。鼠CTSB基因已被定位于14号染色体［3］，其基因组DNA由10个外显子（exon）、9 个内含子（intron）组成。Dong等［4］首次报道了禽的CTSB基因序列，该基因编码序列DNA序列全长为1 023 bp，共编码340个氨基酸。Russo V等发现CTSB 基因与猪背膘厚呈显著相关［5］。Huang和 Tappel［6］认为CTSD酶是与宰后嫩化有关的组织蛋白酶中最重要的酶之一。V Russo等将猪CTSD定位于第2号染色体，位于生长、肉质、胴体性状综合QTL区域，并与部分性状呈显著相关［7］。

1 材料与方法

1.1 试验牛来源及采样方法 以河北华安肉牛场174头西门塔尔牛×鲁西黄牛杂交后代群体作为试验动物群，该群牛全部为20～36月龄的阉牛。从颈静脉采血，采用ACD抗凝，4℃运输，至实验室后保存于-20℃冰箱。

1.2 主要试剂 Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收试剂盒等均购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa），PCR产物用限制性内切酶HindⅢ、AciⅠ、HinfⅠ等均购自Promega公司。

1.3 DNA提取 采用常规酚-氯仿法抽提基因组DNA。应用紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度并估计含量，稀释至50 ng/μL。

1.4 引物设计以及PCR反应条件 根据Genbank公布的CTSB基因序列（NC_007306），应用Primer 5.0软件设计引物，由基诺来普生物技术公司合成。P1：5’GGTTGCAGACCGTACTCC 3’，P2 ：5’CACCAGACTTG －TATAGCAGGA 3’。反应条件：95℃5min；94 ℃ 30 s，62℃30 s，72 ℃ 30 s，33 个循环；72 ℃ 10 s。反应体系为 20μL：50 ng of DNA template，10 pM 引物，0.20 mM dNTP，2.5 mM MgCl2，0.5 u Taq酶。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.5 PCR-RFLP分型 PCR产物酶切选用HindⅢ、AciⅠ、HinfⅠ进行酶切，只有AciⅠ酶切产物呈多态。37℃，12 h，消化产物经2.5%琼脂糖凝胶检测，照相统计分型。

1.6 数据分析 统计基因型，计算等位基因和基因型频率，并进行哈代-温伯格平衡和多态信息含量检验。

运用SAS9.2中的GLM过程中的最小二乘均方Tukey’s检验对经济性状与基因型之间进行关联分析。在模型中包括基因型效应和年龄效应（包含品种及组效应），统计模型如下：

其中，Yijk为经济性状观察值，μ为总体均值，Gi为第i个基因型固定效应，Mj为第j个体的体重（宰前活重分析时去除），作为协变量，eijk为随机残差效应。结果用最小二乘平均值±标准误表示（LSM±SE）。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增 图1是应用引物P1、P2对CTSB基因内含子6进行的扩增，扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶检测，从检验结果来看PCR产物特异性良好，扩增效率较高，满足进一步酶切的需要。

图1 CTSB基因intron6（653bp）的扩增产物

2.2 酶切结果 实验选用HindⅢ、AciⅠ、HinfⅠ中限制酶进行酶切，只有AciⅠ酶切后产生3种基因型，纯合子AA、BB和杂合子AB。见图2。

2.3 基因和基因型频率 由表1可以看出：B等位基因的频率为0.65，明显高于A等位基因的频率0.35，表现为优势等位基因。

图2 CTSB intron6酶切图谱

表1 突变位点基因型频率和基因频率

由表2可以看出：多态信息含量为0.35，处于中度多态。经χ2适合性检验，T5357C位点在该群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。

表2 突变位点等位基因的群体遗传结构

2.4 基因型与经济性状的相关性分析 对突变位点的3种基因型4个经济性状进行相关性分析，结果见表3。从表3可见，AA基因型大理石纹评分显著高于BB型，A等位基因为大理石纹性状有利等位基因。BB基因型活重显著高于AA型，B等位基因为活重性状有利等位基因。

表3 CTSB T5357C位点多态性对牛生产性状的影响

3 讨论

CTSB基因在畜牧业中作为影响肉质和胴体性状的候选基因已有研究。Edyta等发现，CTSB基因外显子7上的一个HpyCH4ⅢRFLP位点呈现多态，其中CC基因型相对于TT基因型对剪切力和脂肪含量的贡献较小（P＜0.05）［8］。陈磊等［9］采用 PCR-RFLP 方法，分析了猪CSTB基因多态性与嫩度性状的关系。Ribeca等研究了CTSD、CTSB等15个基因的遗传变异与皮尔蒙特牛肉质性状的关系［10］。牛CTSB基因定位于牛8号染色体，含有 9 个外显子，全长 8 485 bp（GeneID：281108），但国内未见与牛肉质和胴体性状的相关性分析。本研究中，首次发现CTSB基因内含子6的AciⅠ-RFLP的T5357C突变对大理石纹性状和活重有显著影响，AA型（2.46±1.04）的大理石纹评分显著高于BB型（1.87±0.80），AA型的活重（349.68kg±50.90kg）却明显低于BB型（378.78 kg±49.06 kg）。因此，T5357C位点作为新的既影响牛生长又影响肉质经济性状的分子标记值得探讨，该位点应用于标记辅助选择提供了一定的参考，也为该牛群体的进化研究提供了一些参考。此外活重性状也可能受月龄的影响，所以该位点的应用期望在更多品种中进行更深入验证，为生产实践提供可靠的理论依据。

［1］卢士英，任洪林，柳增善，等.组织蛋白酶B研究进展［J］.河北师范大学学报，2004，28（3）：306-309.

［2］陈琳.溶酶体组织蛋白酶及其在肌肉成熟中的作用［J］.江西农业学报，2008，20（2）：72-75.

［3］Qian F，Frankfater A，Chan S J，et al.The structure of the mouse cathepsin B gene and its putative promoter［J］.DNA and Cell Biology，1991，10（3）：159-168.

［4］Dong S S，Stransky G I，Whitaker C H，et al.Avian cathepsin B cDNA：sequence and demonstration that mRNA of two sizes are produced in cell types producing large quantities of the enzyme［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1995，1251：69-73.

［5］Russo V，Fontanesi L，Davoli R，et al.Investigation of candidate genes for meat quality in dry-cured ham production：the porcine cathepsin B（CTSB） and cycstatin B（CSTB） genes［J］.Anim Genet，2002，33（2）：123-131.

［6］Huang F L，Tappel A L.Action of cathepsins C and D inprotein hydrolysis［J］.Biochem Biophys Acta，1971（236）：739-748.

［7］Russo V，Fontanesi L，Scotti E，et al.Single nucleotide polymorphisms in several porcine cathepsin genes are associated with growth，carcass and production traits in Italian large white pigs［J］.Journal of Animal Science，2008，86：3300-3314.

［8］Edyta J K，Stanislaw J，Rosochacki，et al.Polymorphism in CTSB exon 7 as associated with activity of the lysosomal proteases in longissimus dorsi muscle of growing Friesian bulls［J］.Animal Science Papers and Reports，2007，25（4）：201-209.

［9］陈磊.猪 Cystatin B基因CDNA克隆及遗传多态性分析［J］.中国农业科学，2008，41（7）：2120-2127.

［10］Ribeca C，Bittante G，Albera A，et al.Investigation on variability of candidate genes for meat quality traits in Piemontese cattles［J］.Italian Journal of Animal Science，2010，8：2.

SNP of CTSB Gene Intron 6 and Its Associations with the Economic Traits in Cattle

Deng Gui-xin，Xu Shang-zhong，Gao Xue，et al
（Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100094，China）

174 hybrids（Simmental×Luxi cattles）were used to examine the SNP（single nucleotide polymorphism）of the intron 6 of CTSB gene by PCR-RFLP.A T/C mutation was identified at position of T5357C in CTSB gene（NC_007306）.The effects of the mutation on the meat quality and carcass traits were analyzed.The results showed that T5357C polymorphism significantly associated with the marbling trait and live weight（P＜0.05）.Genotype of AA had better marbling grade than BB genotype;Genotype BB had a better live weight than AA.Thus T5357C might be a good marker for two economic traits.

cattle；CTSB gene；meat quality traits；carcass traits

2011-01-26

国家自然科学

“肉牛主要数量性状基因SNP标记及MA-EPD估计方法研究”，“十二五”国家科技支撑计划（2011BAD28B04）

邓桂馨（1977-），女，讲师，博士研究生。

许尚忠，研究员，博士生导师。

1007-9726（2011）03-0012-03

S823.2

经验交流