绵羊Hoxc8与d11基因甲基化的量子力学特征与功能

赵 静 ，张立岭 ，2，巴 图 ，陈 琦

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018；

2.海南大学动物科学系，海口 570228；3.内蒙古农牧科学院畜牧研究所；4.内蒙古医学院）

绵羊Hoxc8与d11基因甲基化的量子力学特征与功能

赵 静1，张立岭1，2，巴 图3，陈 琦4

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，呼和浩特 010018；

2.海南大学动物科学系，海口 570228；3.内蒙古农牧科学院畜牧研究所；4.内蒙古医学院）

文章研究了蒙古羊和德国美利奴肉羊、陶赛特肉羊、澳洲美利奴细毛羊的Hoxc8和Hoxd11基因及其第1位外显子的甲基化位置、数量、稳定程度，以及甲基化的量子力学性质。与蒙古羊相比，内含子序列有数个碱基的差异，外显子一致。外显子序列的甲基化在转录和翻译过程中的功能，与甲基化导致的分子轨道和量子力学变化有关。甲基化胞嘧啶在密码与反密码中的第2位，决定甲基化是否对转录和翻译产生效应。蒙古羊14枚胸椎个体的父本Hoxc8 exon-1和Hoxd11 exon-1序列甲基化程度高，母本的甲基化程度低；13枚胸椎个体的父本和母本相应序列的甲基化程度都低。

绵羊；Hoxc8和d11；甲基化；量子力学；分子轨道

高等生物的基因组包含数以万计的基因，基因的功能千差万别。虽然许多物种的全基因组已经完成测序，许多功能基因已经克隆定位，部分基因与性状的关系已经明确，但是大部分基因的序列特征与基因表达之间的联系还不完全清楚。动物群体中的许多功能基因的序列几近完全相同，但处于特定位置和特定碱基环境中（例如CpG）C的甲基化（C→5mC），却产生了表观遗传和基因组印记等遗传和表型效应。这些现象是无法用传统的基因序列差异（突变）来解释的。迄今为止，还不能应用生物化学、分子遗传学等完全揭示胞嘧啶第5位碳原子甲基化产生表观遗传效应的机理［1］。而量子力学的理论、技术和方法为揭示生物表观遗传现象提供了新的思路。

量子力学方法早就被用来解释DNA结构与功能之间的关系。Müller等于1927年发现X射线照射果蝇能导致遗传突变［2］。后来，Jordan（1930）提出基因突变是一种量子过程的论断。Bohr则认为，对于生命现象的了解以及揭示生命的遗传现象，需要量子力学的波粒特性［3］。Delbrück研究了基因与突变的关系，发现量子力学理论与遗传突变学说之间有密切的相似性［4］。Schrödinger根据量子力学理论和遗传学研究成果，提出用“量子跃迁”来解释基因突变以及遗传性状以“密码”形式通过染色体而传递等现象［5］。这些论断已被华生和克里克提出的DNA双螺旋结构模型和遗传密码所证实。DNA分子中的胞嘧啶的甲基化所隐藏的信息，同样可以利用分子轨道理论和量子力学方法解释。因此，本研究以蒙古羊、德国美利奴羊、陶赛特羊、澳洲美利奴（澳美）羊为实验对象，研究了它们的Hoxc8与d11基因的甲基化及其量子力学特征。

1 材料与方法

在2007—2010年间，在内蒙古锡林郭勒盟的东乌珠穆沁旗、正蓝旗分别采集200只成年蒙古羊（种公羊20只，种母羊180只）及其后代血样。在正蓝旗采集100只德国美利奴羊、陶赛特羊、澳美羊等种公羊、种母羊及其羔羊的血样，ACD抗凝，液氮冻存。羔羊在5～6月龄屠宰，并确认脊椎数。用基因组DNA提取试剂盒（Promega，A1120）提取绵羊基因组DNA。按照课题组前期实验结果［6-8］和NCBI的GenBank的相应基因序列设计PCR引物，扩增目标序列。测序后，与已知物种序列比对，分析目标基因及其外显子（exon）和内含子（intron）的CpG的数量、位置、密度等。设计针对亚硫酸氢盐处理后序列的PCR引物以及专门的PCR扩增条件。用亚硫酸氢盐转化试剂盒（EpiTect Bisulfite Kit，59104）对目标序列进行亚硫酸氢盐处理并克隆测序，确定甲基化胞嘧啶（5mC）的位置和数量。

胞嘧啶（C）和甲基化胞嘧啶（5mC）的量子力学特征分析主要利用薛定谔（Schrödinger）波动方程、Pauling的杂化轨道和共振理论及其相关的计算方法和结果。HMO法是Hückel根据经验提出的处理π电子体系的近似方法，主要用于π电子体系，例如嘌呤和嘧啶。根据分子内的共轭原子的电子轨道线性组合假设，建立Hückel矩阵，用迭代法计算矩阵方程的特征值和特征向量。再按照理论指数计算公式，得到胞嘧啶的相应理论参数［9-10］。

其中，ai=∫ФiHФidr为第i个原子的Coulomb积分，取碳原子C的ac=0，βij=∫ФiHФidr为第i个原子和第j个原子的共振积分。在HMO理论中，令不相邻原子之间的共振积分为零。δi为第i个杂原子的Coulomb积分经验参数，ηij是第i和第j原子之间的共振积分经验参数。胞嘧啶分子的secular行列式为：

其中，C是特征向量（波函数）矩阵，每列代表由原子轨道组成的分子轨道分量，ψi=ΣCivФv。λ是特征值λi的对角阵，λi为分子轨道能级。

2 结果与讨论

2.1 胞嘧啶分子的杂化轨道及其量子特征 国内外的许多研究表明，胞嘧啶第2位的C=O（sp2杂化轨道，σ+π键）的解离能为6.30 eV或608 KJ/mol，第4位的C-N（sp2杂化轨道，σ键）的解离能为3.03 eV或292 KJ/mol，第5位C-C（sp3杂化轨道，σ键）的解离能为2.55 eV或246 KJ/mol。胞嘧啶的甲基的解离能大大低于C-N和C=O的解离能，因此，胞嘧啶第5位的C要比C-N和C=O易于解离或附着甲基。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的最高占据分子轨道（即电离势，highest ocupied molecular orbital，HOMO）分别为 0.60 β 和 0.53 β，二者的最低空分子轨道（即电子亲合势，lowest unocupied molecular orbital，LEMO）均为-0.80［9］。这表明，C 和 5mC 的电子的量子特征的变化不大，不至于影响碱基配对和碱基堆积。

脊椎动物的5mC含量约为0.1～3.0 mol%，而且呈180°旋转对称。一个甲基（CH3）的3个σ键各自形成以C-H为对称轴的电子云。5mC第5位的C与甲基的C形成一个σ键。所以，5mC分子与胞嘧啶分子相比，多了4个σ键。由于5mC的17个原子也和C的13个原子一样，都处于同一个平面上，所以，多出的4个σ键在空间结构上并不干扰DNA分子单链之间碱基的配对和单链内相邻碱基的堆积。

2.2 甲基化胞嘧啶在遗传密码中的位置及其功能 5-甲基胞嘧啶的生物功能并非体现在DNA双螺旋结构上，而是表现在从DNA转录到RNA，以及从mRNA到tRNA的过程。

5mC可能出现在mRNA密码和tRNA反密码的1～3之间的任何位置。由于5mC全都以CG形式出现，所以，在密码和反密码的3联碱基中，只有2类CG组合：CG在密码碱基的第 1～2 位，包括 CGU、CGC、CGA、CGG；CG在密码碱基的第 2～3 位，UCG、CCG、ACG、GCG。这两类密码组合的碱基的亲水力、碱基堆积力、π键能及分子量都基本相同［10］。但是，密码的5mCG的静电能，极化能，色散能，排斥能，总能的绝对值都高于CG的相应值，特别是后三项更大［11］。这种分子之间作用力的增加，意味着密码在识别和选择反密码的能力上产生差别，客观上具有新增密码种类的效果。这应该是5-甲基胞嘧啶生物学功能上有别于胞嘧啶的物理原因。

由于密码的第2位碱基专一性最强，决定密码的生物学意义，即决定氨基酸的性质及其对蛋白质空间结构［12］。考虑到密码第1位碱基严格，反密码第1位碱基也严格，二者反向互补，所以，mRNA密码的严格碱基对应tRNA反密码的变偶碱基，而tRNA的反密码的严格碱基对应mRNA密码的变偶碱基。最终的结果还是第2位碱基起决定性作用。这就是密码第2位碱基决定密码和反密码之间的缔合能，决定密码的特异性，也决定密码所对应的氨基酸的性质及其对蛋白质空间结构的内在的根本原因。

而处于密码第2位的5mC只占5mC的一定比例。这个推断可以满意地解释为什么有一部分甲基化与表观遗传没有必然联系的原因。这也是研究5mC功能区的必要性和重要性所在。由于这种类型的C处于密码和反密码的变偶位置，所以，在转录和翻译过程中，是否甲基化的意义不大，可以忽略。因此，仅仅确定DNA序列中的甲基化位点的数量，并不能圆满解释甲基化与表观遗传之间的联系。

胞嘧啶的甲基化修饰，在DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase，Dnmt）催化下，经过一步反应即可完成［13］。真核DNA的甲基化，转录为mRNA后参与表观遗传性状表达，而mRNA则参与细胞的精细调节［14］。因此，核酸碱基的甲基化具有明确的功能性。DNA的5mC转录为mRNA后仍然保持甲基化。mRNA的密码与tRNA反密码结合时，胞嘧啶与甲基化胞嘧啶之间的量子力学特征上的差异，决定tRNA选择哪种氨基酸，从而产生表观遗传作用。

5mC的C5位上的CH3，其C-C偶极矩也极小，仅为0.36 D，所以不改变C的疏水性。嘧啶碱基之间的合成或代谢方向为C→5mC，C→U（RNA），U→T。在胞嘧啶脱氨基酶的催化下，胞嘧啶先水解脱氨基，生成尿嘧啶。胞嘧啶经过甲基化酶作用转化为5-甲基胞嘧啶，然后脱氨基后转化为胸腺嘧啶。这个反应是不可逆的。这就保证了5-甲基胞嘧啶的稳定性和遗传信息改变以后的可持续性。

2.3 绵羊Hoxc8与Hoxd11的CpG密度 通过引物8-F1（5’TACCCAGCATGAGCTCCTACTTCGT 3’），8-R1（5’CTCGGAACTTTTCGCTGTGTCT 3’） 和引物 11-F1（5’CTCTTGTGCAATCGATGGCT 3’），11-R1（5’GAAGAGGCGTCATTAAACCCAAGGA 3’）得到目标基因Hoxc8和Hoxd11 基 因 ， 并 提 交 GenBank（Hoxc8，GU479925；Hoxd11，GU059862）。

草食动物功能基因组中的CpG的数量和分布及其甲基化与表观遗传性状的研究刚刚起步。目前已经研究的功能基因主要是调控绵羊脊椎发育的Homeobox基因家族中的 Hoxc8 和 Hoxd11［6-8］。

绵羊 Hoxc8基因全长 2 107 bp，exon-1为 436 bp，exon-2为293 bp，intron为1 378 bp。exon-1的G+C含量61.01%，A+T含量38.99%，共有35个CpG。其中位于密码第1～2位的CpG共2个，全部编码精氨酸。位于密码的第2～3位的CpG共13个，3～1位的密码子占20个。Hoxc8基因exon-2序列中，G+C含量45.8%，低于A＋T的含量54.2%。CpG含量少（12个），分布稀疏。

绵羊Hoxd11基因全长1 772 bp，其中exon-1为778 bp，exon-2 为 236 bp，内含子为 758 bp。exon-1 序列 C+G=76.74%。而A+T仅有23.26%，共有120个CpG，其中位于密码第1～2位的CpG共8个，全部编码精氨酸。位于密码的第2～3位的CpG共47个，3～1位的密码子占65个。Exon-2序列中C+G=47.03%，低于A+T的含量52.97%，只有12个CpG，而且分布分散，所以，本文重点讨论Hoxc8和Hoxd11 exon-1序列及其CpG。

德国肉用美利奴羊、陶赛特羊、澳美羊等国外绵羊品种的Hoxc8和Hoxd11的两个外显子序列都相同，但是，在这两个外显子之间的内含子序列中，有数个碱基的差异。这个差异应该属于遗传多样性，或者中性突变，对基因的表达没有影响。

蒙古羊与德国肉用美利奴羊，陶赛特羊正反交结果表明，蒙古羊的多脊椎特征可以按照表观遗传方式，遗传给杂交后代（5%～10%）。但是，杂交后代的尾形介于两个亲本之间，即蒙古羊的脂尾和国外品种的细长尾属于等显性。

2.4 蒙古羊Hoxc8的甲基化特征 研究表明，蒙古羊的Hoxc8 exon-1中的5mC的数量（或比例）和位置，与胸椎数是13，还是14枚有关。14胸椎蒙古羊和13胸椎蒙古羊的Hoxc8exon-1中的甲基化比例分别为（6.26±4.00）%，（0.54±0.50）%（P=0.017＜0.05）［6］。在甲基化位置上，也有明显差异，14胸椎蒙古羊的甲基化位点密集（都含有一段连续6个甲基化胞嘧啶的区域）。相比之下，13个胸椎蒙古羊的相同序列区间内的甲基化位点分散，不存在甲基化密集区，甲基化胞嘧啶在密码中的位置没有规律。所以，甲基化的比例是个定性的，总体的差异，而甲基化的分布密度，甲基化胞嘧啶在密码内的位置，是导致表观遗传效应的关键因素。

这些测定结果表明，在功能基因序列中，单个的和分散的甲基化胞嘧啶虽然在量子力学参数方面有一定的变化，但是还不足以导致可观察到的表型差异。因此，不能简单地根据甲基化胞嘧啶的数量来推断其功能意义。相反，功能基因序列中存在的多个且集中的甲基化胞嘧啶，特别是在遗传密码第2位胞嘧啶的甲基化，其密集分布所产生的量子力学效应的叠加，才能产生可以观察到的表观遗传效应。所以，胞嘧啶甲基化具有量化的累积效应，而不是简单的定性效应。

蒙古羊Hoxc8 exon-1的甲基化具有明显的基因组印记或表观遗传特征。已经得到的测定结果证实，蒙古羊每个个体的Hoxc8 exon-1中甲基化数量、位置是不固定的，有的多，有的少。这是明显的表观遗传特征，即基因中的目标序列的甲基化程度，与这个序列来自父本或母本有关。对于蒙古羊来说，14枚胸椎个体的父本序列甲基化程度高，母本的甲基化程度低。相比之下，蒙古羊中的13枚胸椎个体，其父本和母本的相应序列的甲基化程度都低。所以，通过测定活体羊的Hoxc8 exon-1甲基化数量或比例，容易识别这只羊是13还是14枚胸椎，从而达到早期选种的目的。

3 结论

虽然目前的量子力学方法还不能满足DNA/RNA核苷酸或者碱基的结构与功能分析的需要，也不可能替代实验室的仪器分析，但是，结合分子遗传实验结果，基本上能够肯定，基因的信息就是碱基和密码的电子信息和能量信息，而且能够进行量子化的定量描述。这些信息的波粒特征和能量特征，具有稳定性和传递性，特异性和相干性，具备了遗传信息应具备的所有条件。遗传学从Mendel的家系水平的性状的经典遗传学，经过Morgan时代的染色体水平的细胞遗传学，到Watson-Crick为代表的分子遗传学，一直发展到目前日渐端倪的量子遗传学，预示着遗传学的发展趋势和方向。量子力学理论与方法有助于表观遗传机制的理解，也有助于解释基因序列甲基化的功能。

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The Quantum Mechanics and the Functions of DNA Methylation of Hoxc8 and Hoxd11 in Sheep

Zhao Jing1，Zhang Li-ling1，2，Batu3，et al
（1.College of Animal Science，Inner Mongolia Agriculture University，Huhhot 010018，China；
2.Department of Animal Sciences，Hainan University，Haikou 570228，China；et al）

The Hoxc8 and Hoxd11 genes among Dorset，German Merino，Australia Merino and Mongolia sheep，and the methylation position and density of exon-1 CpGs were determined.For Hoxc8 and Hoxd11 exons in German Merino，Dorset，Australia Merino，there were no different from that of Mongolia sheep，but several differences in the intron for these breeds.The exon-1 sequence of the function genes was related to the quantum mechanics of the molecular orbit（MO）of DNA methylation.The positions and the numbers of methylated cytosine in the second codes and anti-codes of the genes decided the effects of the DNA methylation on the transcription and translation.The methylation rate from rams of 14 thoracic vertebrae Mongolia sheep were higher，and the ewes were lower，but the methylation rate from the parents of 13 thoracic vertebrae Mongolia sheep were both lower.

sheep；Hoxc8 and d11；methylation；quantum mechanics；MO

2011-03-11

国家自然科学

（30960245）

赵静（1982-），女，博士研究生。

张立岭，男，内蒙古农业大学和海南大学教授。Email：nmglilingzhang@126.com

1007-9726（2011）03-0005-04

S826.1