高能聚焦超声治疗后兔VX2肝癌MR灌注加权成像与微血管密度比较*

广州市第一人民医院1.放射科;2.普外科(广东 广州 510180)

徐宏刚1 徐 波2 陈 亮1 江新青1

高能聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）是利用超声波组织穿透性和聚焦性等物理特性，将体外低能量超声波束聚焦在体内靶区，通过焦域处高能量超声波产生的热效应、空化效应及机械效应等，使局部产生高温(≥65℃)，导致焦域区内细胞产生不可逆死亡、蛋白质变性和组织凝固性坏死，同时能破坏内径<2mm的肿瘤滋养血管，而位于声通道上的组织及焦域周围的组织不会受到损伤[1,2]。VX2瘤株起源于Shope病毒诱发的兔乳头状瘤衍生的鳞癌，经过72次移植传代后正式立株。磁共振灌注加权成像（perfusion-weighted imaging，PWI）是近年来发展起来的磁共振新技术，能定量分析组织微循环血流灌注变化，反映肿瘤血流灌注情况，在检出、监测肿瘤和评价治疗效果等方面有重要价值。

材料与方法

1.1 建立动物模型 新西兰大白兔15只，雌雄不限，体重1.5-2.5kg，由广东省医学动物中心提供。VX2瘤株购于广西医科大学。将瘤株接种于兔腹股沟区皮下或肌肉间，使之成瘤并以之传代。3-4周后将兔全麻后无菌条件下剥离肿瘤，切开瘤体取靠近包膜的灰白色鱼肉样组织置于盛有生理盐水(100ml含青霉素4万u)中，剔除坏死组织及纤维组织，将瘤组织剪碎至约1mm3左右的小块备用。于兔耳缘静脉注入速眠新(0.2ml/kg)全麻后无菌条件下逐层开腹，暴露肝脏，以眼科镊于肝左叶较厚处刺破肝组织并形成口小(3-5mm)底大(5-8mm)的“烧瓶”样窦道,将2-3块剪碎的瘤株植入其中，并以明胶海绵碎块埋塞窦口。确切止血后回纳肝脏，逐层关腹，注入青霉素8万u/kg。术后三天常规注射青霉素和庆大霉素各4万u/kg。2周后待肿瘤直径≥1cm时麻醉后送入HIFU治疗中心，行HIFU治疗，单次治疗，治疗后送回动物中心饲养，于治疗后14天再次行MR检查，检查完毕处死动物，取病理标本迅速固定于中性甲醛溶液中，石腊包埋后作CD34病理检测。

图1 T2WI压脂瘤体呈相对稍高信号，信号较均匀，边界尚清，肝内未见转移灶。图2、3 HIFU治疗后的原始灌注图及rHVB图。图4 治疗后瘤体中央呈灰红色或灰白色，肿瘤细胞坏死明显，血管减少。图5、6 左图为治疗前CD34染色图片，可见微血管生成明显，视野内血管腔多见；右图为治疗后CD34图，可见治疗区为大片无结构坏死区，无微血管生成。图7 治疗后治疗区与非治疗区的SRSmax值与MVD计数比较。

1.2 扫描方法 速眠新0.2ml/kg深度麻醉兔后，使用自制腹带加压固定，采用Philips 1.5T磁共振扫描仪，8通道膝关节扫描线圈，采用呼吸门控行常规T1W、T2W（横断、冠状、矢状）扫描后，行PWI扫描，PWI扫描采用EPI-SE序列、SENSE技术。扫描参数：TR2000ms，TE80ms，层厚2mm，间距0.3mm，NSA 2，视野(FOV)150mm，矩阵256×256。对比剂为钆双胺注射液(Gd-DTPABMA)，剂量0.3mmol/kg，采用高压注射器注射，扫描3个相位后注射对比剂。每只兔扫描获得原始灌注图数量920-1080张不等。

1.3 影像学分析 所有的灌注原始图像均传送至工作站用其配套软件进行处理，分别测量治疗后不同感兴趣区（ROI）信号强度，以ROI内的信号强度平均值为基础构建血流灌注的信号强度-时间曲线，分析ROI在治疗后MR信号变化，计算最大信号下降斜率(maximal signal reduction slope， SRSmax)，并利用相关功能软件绘制相对肝血容量(relative hepatic blood volume，rHBV)图。

ROI测量方法：在肿瘤治疗区和瘤旁肝实质各画3个ROI(取平均值)，注意ROI应尽可能大包括欲测区，各相关数据直接从画图软件右上角图形视图中获取[3]。SRSmax计算公式为：SRSmax=(SIpre-SIp)/TTP，SIpre为PWI图像稳定后至信号下降前的ROI信号强度的平均值，SIp为灌注峰值时刻的ROI信号强度值，TTP为达峰时间(ROI信号强度下降的开始时刻到降为峰值时刻之间的时间宽度)。

1.4 病理学检测 肿瘤内MVD检测采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidinperosida，SP)三步法，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色。所用一抗为抗CD34(武汉博士德公司，工作浓度1：50)。采用PBS液代替一抗作阴性对照，全部为阴性；采用已知MVD阳性的皮肤血管肉瘤标本取代VX2瘤组织作为阳性对照，全部为阳性。MVD计数参照文献[4,5]方法进行，先在低倍镜(×40)下全面观察切片，选出血管密度区(即“热点”)，后在高倍镜(×400)下分别取3个视野计数微血管，以染成棕色血管内皮或内皮细胞束作为1条血管数，血管腔和腔内红细胞不作为计数单位，与抗体起反应的巨噬细胞和浆细胞等在镜下根据形态学差异予以排除，以3个高倍镜视野的微血管平均数作为该切片MVD值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 11.0软件进行统计分析，不同ROI的SRSmax的比较采用单因素方差分析、非参数检验和t检验，判断相关性采用Pearson分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

结 果

2.1 VX2瘤兔建模与生存情况15只VX2瘤兔均成功建模，术后14天扫描，发现肿瘤共18个，其中12只1个病灶，3只2个病灶，瘤体最大径分别为（1.27±0.15）cm，瘤体平扫T1W为稍低信号，T2W为稍高信号，信号较均匀，部分边界欠清楚。病灶局限于肝脏内，未见转移（图1）。治疗后肿瘤体积均较前有所增大，治疗后14天瘤体最大径约（1.95±0.48）cm ，T2W信号不均匀，可见高、低混杂信号。2只荷瘤兔发现转移灶，腹腔种植、腹水可见。

2.2 治疗后兔VX2肝癌的PWI及MVD变化 治疗后rHVB图显示VX2瘤治疗区（即肿瘤实质区）灌注程度降低，其SRSmax值较治疗前明显下降；非治疗区（即瘤旁肝实质）血流灌注未见明显变化，其SRSmax值治疗前后无明显差异（图2、3）。

2.3 病理改变 治疗区肉眼观察肿瘤血管减少，镜下见毛细血管内皮细胞退化，细胞坏死明显，瘤周见水肿和炎性反应。非治疗区大体肉眼观察见瘤体呈灰白色鱼肉样，表面血管增多增粗，镜下肿瘤边界不清，核大、分裂像多见，间质少，微血管丰富（图4）。

病理检测显示CD34主要表达于兔肝VX2瘤血管内皮细胞,呈棕黄色、浅褐色；肿瘤区内巨噬细胞、浆细胞及肿瘤和瘤旁肝实质汇管区内少量血管亦偶有非特异性染色（图5、6）。治疗后治疗区CD34低表达，MVD计数明显低于非治疗区（图7）。

2.4 统计学结果 治疗前瘤体实质区SRSmax值明显高于瘤旁肝实质，治疗后SRSmax值改变明显，低于瘤旁肝实质（表1）；治疗后不同ROI的SRSmax与MVD作方差齐性检验无统计学差异，进一步作直线相关分析，治疗区SRSmax与MVD呈正相关（r=0.574，P=0.004）（表2）。

讨 论

PWI可清楚显示肿瘤微循环血流状况，主要采用动态团注示踪(dynamic bolus tracking,DBT)法，其基本原理来源于核医学中的示踪剂稀释原理及中央容积定理，通过团注对比剂后，采用超快速成像技术，检测对比剂首过组织时引起的局部信号强度改变，计算其T1、T2或重T2(T2*)弛豫率的变化，再通过适当数学模型变换得到组织血流灌注的定量信息，用于了解其血液动力学特征，评价微循环状态[6,7]。

肿瘤血管生成是实体性肿瘤生长和转移基础[8]。肝癌具有很强的诱导血管生成能力,其血管生成程度与肿瘤的生长、转移及预后密切相关,故本研究选择ROI内MVD计数作为肿瘤血管生成、破坏的程度和范围标记物进行病理检测的结果认为较为可靠[8,9]，本实验证明，无论治疗前、后，不同ROI的灌注程度及范围与MVD计数结果一致。治疗前兔肝移植瘤治疗区SRSmax明显增高，且高于非治疗区，说明肿瘤组织有较多的新生微细血管，血流灌注程度非常高，这也是肿瘤生长、转移的前提。HIFU治疗后治疗区SRSmax明显下降，其差异有统计学意义，同时病理检测显示CD34呈低表达，MVD计数较治疗前明显降低，与PWI表现一致，两者呈正相关，这说明HIFU可以有效的破坏肿瘤的微血管，减少瘤体微血管形成，破坏肿瘤血管生成，从而减少肿瘤血供，达到灭活肿瘤的目的。

表1 兔肝VX2种植瘤治疗组HIFU治疗前、后SRSmax比较

综上，PWI作为一种无创性功能成像方法，在脏器功能研究、病灶检出、肿瘤性质、预测肿瘤疗效及判断预后等方面有巨大潜力，同时病理、影像学对照对于判断肿瘤组织来源、血供情况等非常重要，SRSmax结合MVD可能作为评价肿瘤微血管生成、破坏的指标，但如何应用于临床仍有待进一步研究。

1.Yang R,Reilly CR,Rescorla FJ,et al.High intensity focused ultrasound in the treatment of experimental liver cancer[J].Arch Surg,1991,126(7):1002-1009.

2.黄海玉,刘小乐,王冰,等.高强度聚焦超声治疗子宫肌瘤的研究进展. [J] 罕少疾病杂志, 2009, 16(4):23-25.

3.江新青，陈亮，魏新华，等. 兔VX2肝癌高能聚焦超声治疗后MR灌注加权成像的研究[J]. 中华放射学杂志, 2009,43(2): 196-200.

4.Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors[J]. BreastCancerResTreat, 1995, 36(2): 169-180.

5.Vermeulun PB,Verhoeven D, Fierens H, et al. Microvesselquantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study[J]. Br JCancer, 1995, 71(2): 340-343.

6.Reinig JW,Dwyer AF,Miller DL,et al.Liver metastases detection:comparative sensitivities of MR imaging and CT scanning[J].Radiology 2003;162(1):43-47.

7.Heiken JP,Weyman PJ,Lee JKT,et al.Detection of focal hepatic masses:Prospective evaluation with CT,delayed CT, CTAP,and MR imaging[J].Radiology 1999;171:47-51.

8.姜慧杰，徐克，张慧博，等. 多层螺旋CT灌注成像活体评价肝VX2移植瘤新生血管生成[J].中国医学影像技术,2007,23(7):967-970.

9.Ferrari FS,Megliola A,Scorzelli A,et al.Treatment of HCC through radiofrequency904学杂志ablation and laser ablation.Comparison of techniques and long-term results[J].Radiol Med (Torino).2007,12(3):377-393.