实时荧光定量RT-PCR与ELISA检测孕妇血清风疹病毒的比较分析 *

赵立红

(泰山医学院附属泰山医院检验科，山东泰安 271000)

风疹(rubella virus，RV)是披膜病毒科风疹病毒属的唯一成员，人是唯一的自然宿主。孕妇妊娠前3个月感染RV，RV会通过胎盘感染胎儿，导致孕妇流产或死胎，甚至引起新生儿一系列的器官畸形等先天性风疹综合征(congenital rubella syndrome，CRS)[1]。因此，采用及时准确快捷的RV诊断方法具有十分重要的意义。我们采用TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法检测孕妇血清标本中风疹病毒RNA，并与传统方法-风疹病毒免疫球蛋白M(IgM)酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行比较分析。

1 材料与方法

1.1金标准

细胞培养法

1.2临床标本

收集2008年6月至2010年10月泰安市中心医院产前诊断门诊细胞培养法确诊的风疹病毒阳性孕妇血清标本126例，年龄22～36岁，平均年龄28岁；正常对照组107例为女性健康查体者，无与风疹病人接触史，年龄24～29岁，平均年龄26岁。

1.3仪器与试剂

PE7500全自动PCR扩增分析仪为美国PE公司产品；风疹病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒购自中山医科大学达安基因诊断有限公司；DY-1型酶标仪系美国BIO-TEK公司产品；风疹病毒ELISA IgM试剂盒购自美国罗氏公司。

1.4风疹病毒ELISA IgM抗体测定

严格按照试剂盒说明书操作。

1.5实时荧光定量RT-PCR检测风疹病毒RNA。

严格按照试剂盒说明书操作。反应条件：93℃预变性2min，然后93℃变性45s，55℃退火60s，先做10个循环，最后按93℃变性30s，55℃退火45s，做30个循环。于PE7500全自动PCR扩增分析仪上进行 PCR 扩增。

1.6阳性判定标准

实时荧光定量RT-PCR法

如果Ct值<27，则实验结果为阳性。

ELISA IgM 抗体法

以待检血清吸光度值(P)与阴性对照血清吸光度值(N)的比值P/N≥2.1为阳性，波长为450nm。

1.7统计学处理

直线回归与相关、敏感度、特异度应用SPSS 10.0软件以及PEMS3.1软件进行统计学分析。

2 结 果

2.1定量阳性标准动力学曲线及标准回归曲线

10倍系列稀释的标准品cDNA(1.0×107-1.0×103拷贝/μl)在PE7500全自动实时荧光定量PCR仪上扩增后，系统根据荧光值的变化规律，自动生成标准动力学曲线(图1)。通过baseline 的设定，系统自动生成标准回归曲线(图2)。由标准回归曲线可以看出，该标准品不同稀释度的各个有效反应点均落在标准曲线的相应位置上，线性相关系数r为-0.9991(r2=0.9982)，表明10倍系列稀释的不同浓度的标准品cDNA的自然对数值与相应的Ct值具有良好的相关性，证实了风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法定量的准确性。

图1 定量阳性标准动力学曲线(基线下水平直线为阴性对照)

图3 定量阳性标准回归曲线(相关系数r2=0.9982)

2.2风疹病毒实时荧光定量RT-PCR法检测结果

风疹病毒阳性孕妇血清标本126例，117例被检出阳性，9例假阴性；女性健康查体者107例，105例被检出阴性，2例假阳性。以细胞培养法作为金标准，风疹病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法的敏感度和特异度分别为92.9%，98.1%。

2.3ELISA IgM抗体法检测结果

风疹病毒阳性孕妇血清标本126例，123例被检出阳性，3例假阴性；女性健康查体者107例，93例被检出阴性，14例假阳性。以细胞培养法作为金标准，ELISA IgM抗体法的敏感度和特异度分别为97.6%，86.9%。

2.4实时荧光RT-PCR法与ELISA IgM抗体法两种方法特异度和敏感度比较

实时荧光RT-PCR与ELISA IgM抗体法两种方法特异度和敏感度，见表1。

表1 比较实时荧光RT-PCR法与ELISA IgM抗体法特异度和敏感度

检测方法 特异度敏感度 实时荧光RT-PCR法98.1% 92.9%ELISA IgM抗体法86.9%97.6%

两种方法敏感度进行比较，u=1.75<1.96，p>0.05，因而，实时荧光RT-PCR与ELISA IgM抗体法两种方法敏感度无统计学意义上的差异。两种方法特异度进行比较，u=3.11>2.58，p<0.01，因而，实时荧光RT-PCR的特异度明显高于ELISA IgM抗体法的特异度。

3 讨 论

目前检测风疹多采用ELISA法测定患者血清中的特异性风疹IgM抗体，该方法快速、灵敏，但容易引起假阳性反应。近年出现的实时荧光定量PCR技术，通过TaqMan探针杂交提高了特异性，引进光谱技术进行准确定量，避免了交叉污染，使其成为基础研究和分子生物学诊断领域最热门的诊断技术之一[2]。Johanna采用实时荧光定量RT-PCR检测MMR疫苗病毒颗粒，证明其特异度与金标准-细胞培养法相似[3]。Chen等建立的实时荧光定量RT-PCR诊断SARS-CoV 感染，其敏感度和特异度均非常高[4]。

本研究采用实时荧光定量RT-PCR检测孕妇血清风疹病毒RNA，并与ELISA法比较其敏感度与特异度，实验证明，两种方法的敏感度无显著性差异，实时荧光定量RT-PCR的特异度明显高于ELISA法。

实时荧光定量PCR方法弥补了常规PCR易产生假阳性和不能定量两大技术缺陷。将其运用于RV感染的早期临床诊断，可以最大限度地减少死胎、畸胎等的发生率。由此可见，风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR是一种简便、快速、高特异性、高敏感性及定量准确的检测方法，在临床风疹早期诊断中具有很大的应用潜力。

致谢：本研究得到了中山医科大学达安基因公司的大力协助，在此表示衷心的感谢！

[1] Edlich RF, Winters KL, Long WB 3rd, Gubler KD. Rubella and congenital rubella( German measles). [J] Long Term Eff Med Implants 2005; 15(3): 319-328.

[2] Klein D. Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations.TRENDS in Molecular Medicine, 2002;8(6):257-260.

[3] Johanna A C， Schalk , Christa van den Elzen ,et al. Estimation of the number of infectious measles viruses in live virus vaccines using quantitative real-time PCR[J]. J Virol Methods, 2004 ,117(2):179-187.

[4] Chen W, Xu Z, Mu J, et al. Real-time quantitative fluorescent reverse transcriptase-PCR for detection of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus RNA[J]. Molecular Diagnosis, 2004;8(4):231-235.