宫颈癌组织中DNA甲基转移酶1、3A 和3B mRNA的表达*

姜树原 张颜波 随 鑫 黄丽华 赵志英 邵 国,4

(1.包头医学院生物医学研究中心 ，内蒙古 包头 014010；2. 泰山医学院附属医院神经内科, 山东 泰安 27100；3.包钢医院神经外科，内蒙古 包头 014010； 4.汕头大学医学院分析细胞学实验室，广东 汕头 515041)

宫颈癌是在女性常见的恶性肿瘤，虽然90%的宫颈鳞癌和50%的宫颈腺癌都可以检测到HPV DNA，但迄今为止宫颈癌发生的确切分子机制仍不清楚，已发现宫颈癌组织中多种肿瘤相关基因异常甲基化[1][2]。在人类的大多数的肿瘤当中，都有DNA甲基化异常的存在。人类肿瘤当中,一般表现为整体DNA甲基化降低，并伴有特定基因区域的高甲基化。DNA甲基化降低会改变染色体的结构而导致染色体不稳定，而CpG岛的高甲基化则发生在特定肿瘤相关基因并使其低表达或沉寂。DNA甲基化的改变可能可以作为癌症风险评估、癌症早期诊断和癌症病人不良预后的标志。DNA的甲基化是靠DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT) 催化完成的。在Peter John研究小组的文章中指出，癌症病人样本中发现5/10的DNMT3A上调，6/10的DNMT1上调，8/10的DNMT3B上调。且DNMT3B上调的幅度最大，与对照相比，平均增加7.5倍。因此，DNMT3B在癌症的发生中可能有重要作用[3]。本研究用real-time PCR技术检测了宫颈癌及癌前病变组织中DNMT1、3A和3B mRNA mRNA的表达, 探讨DNMT1、3A和3B mRNA在宫颈癌发生发展中的作用, 以期进一步了解宫颈癌的发生机制。

1 材料与方法

1.1 标本及试剂

30例宫颈样本均来自包头医学院附属医院的新鲜标本；RNeasy Mini Kit, QIAGEN; superscripⅡRT 酶(1 ×108U/ L ) , Invitrogen ; (10 mmol/ L、0. 25 mmol/ L),random引物(0. 5 g/ L) , The Brilliant. SYBR Green QPCR master mix(stratagene)；焦碳酸二乙酯(DEPC) ,Sigma ;琼脂糖,Spanish；其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 引 物

根据文献和Genebank序列，用Primer premier 5.0软件分别设计DNMT1、3A和3B及内参GAPDH基因的引物。引物由上海生物公司合成，引物序列如下。

GAPDH F： 5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3'；

GAPDH R： 5'-GGTCATTGATGGCAACAA-3'；

DNMT3A F : 5-GACAAGAATGCCACCAAAGC;

DNMT3A R: 5-CGTCTCCGAACCACATGAC;

DNMT1F：AACCTTCACCTAGCCCCAG；

DNMT1R：CTCATCCGATTTGGCTCTTTCA；

DNMT3B F：AGGGAAGACTCGATCCTCGTC；

DNMT3B R： GTGTGTAGCTTAGCAGACTGG；

1.3 RT-PCR及real-time PCR

RT-PCR：用QIAGEN公司提供的RNeasy Mini Kit提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA纯度和含量。逆转录反应：在0.5ml Eppendorf管中加入总RNA 2 μg，random hexamer引物1 ul，用DEPC水补足12 μl。70 ℃，孵育10 min；立刻冰浴1 min。再加入5×RT反应缓冲液4 μl；dNTP(10mM)，1 μl；DTT(0.1M)，2 μl，混匀，42 ℃孵育5 min。随后加入SuperscripⅡRT酶 1 μl，在42 ℃，反应50 min；70 ℃，反应15 min。得到cDNA产物-20 ℃保存。Real-time PCR：使用ABI的96孔板，每孔依次加入cDNA 1μl，2×mix 12.5 μl，3′和5′端引物(5μmol.L-1) 各1 μl，无菌水9.5 μl，在ABI 7900 real-time PCR反应仪上反应，每个样本设3个复空。反应参数：94 ℃预变性3 min，再进行92 ℃，30 s；54.5 ℃，35 s；72 ℃，30 s(40 cycles)，最后72 ℃延伸5 min停止反应。

1.4 数据分析及统计学处理

2 结 果

宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 1mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是 0.30±0.1、0.26±0.12和0.10±0.04, 宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 1表达有显著差异(P<0.05)，而宫颈上皮内瘤变与宫颈癌组织和正常宫颈在DNMT 1表达上没有显著差异(P>0.05)(图1)； 宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT3A mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是 0.94±0.27、0.51±0.24和0.13±0.04,三组在DNMT3A mRNA表达上有显著性差异(P<0.05)(图2)； 宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 3B mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是 0.30±0.09、0.28±0.11和0.11±0.04，宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 3B表达有显著差异(P<0.05)，而宫颈上皮内瘤变与宫颈癌组织和正常宫颈在DNMT 3B表达上没有显著差异(P>0.05)(图3)。

图1 DNMT 1 mRNA 对GAPDH mRNA相对丰度图

CC：宫颈癌组织；CIN：宫颈上皮内瘤变；Normal：正常宫颈(*P<0.05,n=10)

图2 DNMT 3A mRNA 对GAPDH mRNA相对丰度图

CC：宫颈癌组织；CIN：宫颈上皮内瘤变；Normal：正常宫颈(*P<0.05,n=10;#P<0.05,n=10)

图3 DNMT 3B mRNA 对GAPDH mRNA相对丰度图

CC：宫颈癌组织；CIN：宫颈上皮内瘤变；Normal：正常宫颈(*P<0.05,n=10)

3 讨 论

DNA甲基化与肿瘤密切相关，肿瘤的DNA甲基化改变表现为总体的甲基化水平降低与特定基因启动子区CpG岛的甲基化水平升高，特定基因主要为抑癌基因与修复基因，它们的甲基化导致抑癌基因沉默与修复基因失活,造成肿瘤抑制丧失与基因损伤增加; 而总体地低甲基化使癌基因活化和使染色体不稳定。催化DNA中胞嘧啶发生甲基化的酶DNMT到目前为止有3种DNMT，它们是DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B和DNMT 3L[4]。DNMT1是持续性甲基化酶，其底物是半甲基化的DNA 。DNMT2的功能尚不明朗，有报道称它不甲基化DNA而是甲基化天冬氨酸tRNA。DNMT3A和DNMT3B有从头催化DNA甲基化的能力。DNMT3L单独没有催化能力，但它可以和DNMT3A和DNMT3B相互作用，调节其活性[5]。

与Peter John研究小组的研究结果相符[3]，本研究结果显示DNMT1、3A和3B mRNA表达率从正常宫颈、CIN至宫颈癌呈逐渐升高趋势, 并且正常宫颈和宫颈癌差异有统计学意义(P<0.05),而只有DNMT3A mRNA正常宫颈、CIN和宫颈癌中逐渐升高并具有统计学意义(P<0.05),而DNMT1和DNMT3B在CIN中的表达高于正常宫颈且低于宫颈癌，但没有统计学意义(P>0.05)。赵先兰等报道DNMT1 mRNA表达率从正常宫颈、CIN至宫颈癌呈逐渐升高趋势, 差异有统计学意义(P< 0. 05)[6],虽然赵兰先等使用的是原位杂交而我们使用的是real-time PCR的技术，并且我们研究的样本数较少，但我们和赵兰先等在DNMT1 mRNA表达率从正常宫颈、CIN至宫颈癌变化趋势一样的。由于我们使用的样本较少，DNMT1和DNMT3B在CIN中的表达高于正常宫颈且低于宫颈癌，但没有统计学意义，若增加样本量，它们之间会有显著性差异。因此本研究报道的DNMT1、3A和3B mRNA表达率从正常宫颈、CIN至宫颈癌的变化规律提示了DNMT在宫颈癌的发生和发展中扮演了重要角色。

虽然我们研究结果显示DNMT1、3A和3B可能都参与了宫颈癌的发生和发展，但宫颈癌的发生可能有多种基因甲基化发生改变，特别是抑癌基因因甲基化而失活[7，8]，一些基因的异常甲基化，特别是在CIN中的异常，对于临床上宫颈癌的防治有重要意义[9]。要明确DNMT1、3A和3B各自在宫颈癌的发生和发展中的作用，特别是它们在抑癌基因因甲基化中的作用，对于宫颈癌的治疗有重要意义，而明确它们的作用则需要进一步深入研究。

[1] Virmani AK, Muller C, Rathi A, et al. Aberrant methylation during cervical carcinogenesis[J].Clin Cancer Res, 2001,7: 584-589.

[2] Sova P, Feng Q, Geiss G, et al. Discovery of novel methylation biomarkers in cervical carcinoma by global demethylation and microarray analysis[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2006,15: 114-123.

[3] Robertson KD, Uzvolgyi E, Liang G, et al. The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors[J].Nucleic Acids Res, 1999,27: 2291-2298.

[4] Bestor TH. The DNA methyltransferases of mammals[J].Hum Mol Genet, 2000,9: 2395-2402.

[5] Van Emburgh BO, Robertson KD. Modulation of Dnmt3b function in vitro by interactions with Dnmt3L, Dnmt3a and Dnmt3b splice variants[J].Nucleic Acids Res, 2011.

[6] 赵先兰., 饶燕玲., 孟志英., 等. 宫颈癌组织中DNA甲基转移酶1 mRNA的表达[J].郑州大学学报(医学版), 2009,44: 120-122.

[7] Zhao S, Sun G, Tony PW, et al. Expression and methylation status of the Syk gene in cervical carcinoma[J].Arch Gynecol Obstet, 2011,283: 1113-1119.

[8] Rizvi MM, Alam MS, Ali A, et al. Aberrant promoter methylation and inactivation of PTEN gene in cervical carcinoma from Indian population[J].J Cancer Res Clin Oncol, 2011,137: 1255-1262.

[9] Terra AP, Murta EF, Maluf PJ, et al. Aberrant promoter methylation can be useful as a marker of recurrent disease in patients with cervical intraepithelial neoplasia grade III[J].Tumori, 2007,93: 572-579.