现用梅毒血清试验临床应用价值评估

龚匡隆，尤永燕，张津萍，沙仲，孙厚华

中国医学科学院/中国协和医科大学皮肤病研究所, 南京 210042

梅毒(syphilis)是我国乙类传染病中重点防治的疾病。当人体感染梅毒螺旋体(Treponemapallidum，TP)4～10周后，血清中可产生抗类脂抗原的非特异性反应素和抗TP抗原的特异性抗体(IgM/IgG)。正规治疗可控制炎症，消除损害，防止进一步发展；同时患者体内IgM和非TP血清抗体逐步下降直至转阴，达到临床和血清学意义上的痊愈。血清抗体的梅毒实验室检测对临床诊断及疗效监测具有重要意义。本文采用TP-IgM酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(TP-IgM ELISA)、快速血浆反应素(rapid plasma reagin，RPR)环状卡片试验、TP明胶凝集试验(Treponemapallidumparticle assay，TPPA)3种实验方法，观察135例梅毒患者正规治疗前、后血清抗体的变化，探讨梅毒血清试验对梅毒诊断和随访的临床意义。

1 材料和方法

1.1 病例

135例梅毒患者均来自我院性病科，诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准》(WB273-2007)。其中男性108例、女性27例；平均年龄36岁(20～42岁)；24例为一期梅毒患者(硬下疳，均为男性)，93例为二期梅毒患者(其中女性27例)，18例为早期潜伏梅毒患者(均为男性)。收集正规治疗前、后梅毒患者血清进行检测。由于梅毒合并人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的患者较多，临床表现和血清抗体变化较复杂。为排除影响RPR试验和TP-IgM ELISA的多种因素，本研究采用HIV 1+2型抗体诊断试剂，选取HIV阴性梅毒患者作为研究对象。

1.2 检测方法

1.2.1RPR试验——梅毒筛查试验TP感染后，人体迅速对TP表面的脂质发生免疫应答，3～4周产生抗类脂抗原的抗体(反应素)。这些抗体主要成分是IgM/IgG混合抗体。抗原和抗体混合时，由于摇动、碰撞，形成肉眼可见的絮状沉淀反应，即为阳性；反之则为阴性。①定性试验：吸取0.05 ml血清或血浆，均匀涂布在整个反应卡片圈内，加入摇匀的抗原1滴(约0.016 7 ml)，置水平旋转器旋转8 min 〔(100±2)r/min〕，立即在强光下观察结果。圆圈内出现小、中到大的黑色絮状物，液体清亮为阳性；圆圈内仅见碳颗粒集于中央一点或均匀分散为阴性。②定量试验：吸取0.05 ml血清或血浆，以等渗盐水系列稀释至所需倍数，滴加抗原，旋转时间、速度和观察结果同定性试验。

1.2.2TPPA——确证试验TPPA是将超声裂解的TP作为抗原致敏明胶颗粒，一旦与梅毒抗体或免疫血清相遇，在适宜条件下产生肉眼可见的凝集反应(阳性反应)。TPPA能检测血清或血浆中抗TP的特异性抗体。在待检血清中分别加入未致敏粒子(空白对照)、致敏细胞，将反应板置震荡器震荡30 s；置有盖湿盒，15～25 ℃避光避震孵育2 h(或放4 ℃冰箱过夜)后观察结果。粒子光滑覆盖整个孔底，边缘有折叠或周围有一明显细胞环为阳性；粒子紧密沉积孔底中央为阴性。当空白对照为阴性时，实验结果可靠。

1.2.3TP-IgMELISA——检测特异性IgM抗体用抗人IgM(抗人μ链)包被固相板，借以捕获血清中的IgM(包括特异性和非特异性的IgM)。实验前将固相板和标本置于室温(21～25 ℃)30 min；在相应微孔中加入待检测血清和各质控品，室温孵育20 min，洗板5次；加入酶结合物，室温孵育20 min，洗板5次；加入TMB底物液，室温孵育10 min；加入终止液，15 min内用酶标仪读出A450。根据要求计算设定阀值〔cut-off值=A校正液×校正系数(0.5)〕，用样品A值和cut-off值计算出每个样本的抗体值。阳性：标本A值≥cut-off值；阴性：标本A值

1.2.4HIV快速免疫色谱法(AbbottJapan产品) 采用吸附有显色标记的HIV重组抗原滤纸条，快速检测标本中的HIV抗体。吸取待检测血清或血浆于样品窗，静置，比对标准色块，读取结果。

1.2.5TP暗视野显微镜检查对一期梅毒患者(硬下疳)进行TP暗视野显微镜检查(darkfield microscopy，DM)。

2 结果

2.1 患者一般情况

135例梅毒患者中，一期梅毒患者临床表现为生殖器冠状沟、龟头、包皮等部位发生典型的硬下疳。一般为单发，少数多个，直径1～3 cm，圆形或椭圆形；浅在溃疡或糜烂红斑，略隆起高出皮面，基底坚实，表面干净或仅见少量浆液性分泌物，内含TP。二期梅毒患者主要表现为皮肤、黏膜损害，如斑疹、斑丘疹、丘疹和扁平湿疣等。早期潜伏梅毒患者均曾有不洁性交，2年内未经治疗或经不正规治疗后，症状和体征消退，就诊时无任何临床表现。

所有梅毒患者的治疗均采用苄星青霉素G 240万u，分两侧臀部肌注，每周1次，共3次。经治疗后梅毒患者临床症状和体征消失，按要求进行血清学检查。

2.2 实验室检查

治疗前各期梅毒患者实验室检查如下。24例一期梅毒患者：TP暗视野检查均阳性，敏感度100.0%；RPR试验20例阳性，4例阴性，敏感度83.3%；TPPA和TP-IgM ELISA 22例阳性，2例阴性，敏感度91.7%。93例二期梅毒患者：RPR试验、TPPA和TP-IgM ELISA全部阳性，敏感度均为100.0%。18例早期潜伏梅毒患者：RPR试验和TP-IgM ELISA均16例阳性，2例阴性，敏感度88.9%；TPPA 18例阳性，敏感度100.0%(表1)。

131例梅毒患者经正规治疗后并随访成功。

表1135例梅毒患者治疗前梅毒血清试验结果

Tab.1Resultsoftreponemalserologictestfrom135casesbeforetreatment

Stage of syphilis nBefore treatment (positive)DM(%) RPR(%) TPPA(%) TP-IgMELISA(%) Primary 24 24(100.0) 20(83.3) 22(91.7) 22(91.7)Secondary 93 93(100.0) 93(100.0) 93(100.0)Early latent 18 16(88.9) 18(100.0) 16(88.9)

RPR试验检测20例一期梅毒患，3个月后阳性率90.0%，6个月后阳性率70.0%，9个月后阳性率20.0%，12个月后阴转率100%。TP-IgM ELISA检测22例一期梅毒患者，3个月后阳性率72.7%，6个月后阳性率45.5%，9个月后阳性率9.1%，12个月后全部阴性，阴转率100%。RPR试验和TP-IgM ELISA检测93例二期梅毒患者，3、6个月后均阳性，9个月后阳性率分别为79.6%、82.8%，12个月后阳性率分别为35.5%、32.3%。RPR试验和TP-IgM ELISA检测16例早期潜伏梅毒患者，3、6、9个月后阳性率均为100%，12个月后阳性率均为56.3%。131例梅毒患者治疗后血清变化与时间的关系见表2。

表2131例梅毒患者治疗后血清变化与时间的关系

Tab.2Relationshipbetweenchangesinserologicalresultsandtimefrom131casesaftertreatment

Stage of syphilisnRPR (month)3(%) 6(%) 9(%) 12(%)nTP-IgM ELISA (month)3(%) 6(%) 9(%) 12(%)Primary 20 18(90.0) 14(70.0) 4(20.0) 0 22 16(72.7) 10(45.5) 2(9.1) 0Secondary 93 93(100.0) 93(100.0) 74(79.6) 33(35.5) 93 93(100.0) 93(100.0) 77(82.8) 30(32.3)Early latent 16 16(100.0) 16(100.0) 16(100.0) 9(56.3) 16 16(100.0) 16(100.0) 16(100.0) 9(56.3)

3 讨论

梅毒的诊断必须根据病史、临床症状和体征、实验室检查综合分析，其中血清学检查对梅毒的确诊有十分重要意义。

TPPA[1,2]是梅毒特异性实验室检查，主要检测抗TP IgM/IgG抗体，是梅毒确证试验。人体被梅毒感染后，体内即可产生抗TP抗体，且终身保持。本研究发现，TPPA对治疗前二期梅毒患者检出率为100%，而且对早期潜伏者，尽管尚无任何体征，但检出率已达100%，显示其相当高的灵敏度。因此，TPPA可作为梅毒常规诊断的最佳方法。但其对一期梅毒的检出率只有91.7%，而暗视野显微镜检查的检出率是100%，因此血清学实验配合暗视野显微镜检查梅毒硬下疳患者是十分必要的。

RPR试验[1]是梅毒非特异性实验室检查，主要检测抗心磷脂IgM/IgG抗体，常用于梅毒的筛查和疗效观察。本研究用RPR试验筛查，一期梅毒患者阳性率83.3%，早期潜伏梅毒患者阳性率88.9%，二期梅毒患者阳性率100%。尽管不能达到完全确诊，但由于RPR试验方法简单、快速、敏感度和特异度较好、价格便宜，可适用于大量人群的筛查，仍是梅毒初筛的好方法。早期梅毒治疗后，RPR试验的血清滴度可下降转为阴性，也可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。

TP-IgM ELISA为梅毒特异性试验，检测患者的抗TP IgM抗体。IgM抗体是梅毒感染时最早产生的抗体，并随治疗而逐渐下降或消失，因此理论上认为检测TP-IgM抗体对早期梅毒、梅毒的再感染、晚期梅毒的诊断及疗效判断有作用。本研究对135例梅毒患者治疗前血清进行TP-IgM ELASA，早期潜伏、一期和二期梅毒的敏感度分别为88.9%、91.7%和100%，与McMillan等[3]报道的69%、90%和100%基本一致。另外，其对治疗前早期潜伏及一期梅毒的检出率与RPR试验的88.9%和83.3%相似，正规治疗12个月后与RPR试验对梅毒患者的检出率也相似，并没有发现其特别高的灵敏度，而且因TP-IgM ELISA试剂价格昂贵，不适用于临床常规检测。本实验结果表明，在临床诊断中，RPR试验可部分代替 TP-IgM ELISA。

梅毒患者经正规治疗后临床症状和体征消失，应定期随访。McMillan等[4]对229例早期梅毒患者正规治疗12个月后的血清进行性病研究实验室试验(venereal disease research laboratory test，VDRL试验)和Mercia®IgM酶免疫分析法观察，阴转率分别为70%和92%。目前，国内对正规治疗12个月后的梅毒患者进行RPR试验和TP-IgM ELISA分析血清变化未见报道。本研究对梅毒患者正规治疗12个月后的血清试验阴转率进行观察，结果显示RPR试验检出阴转率67.4%(87/129)，TP-IgM ELISA检出阴转率70.3%(92/131)，与文献报道结果存在差异。按梅毒的病程分析，一期梅毒患者RPR试验和TP-IgM ELISA检出阴转率100.0%；二期梅毒RPR试验检出阴转率64.5%，TP-IgM ELISA为67.7%；早期潜伏梅毒患者RPR试验和TP-IgM ELISA检出阴转率仅43.7%，也存在较大差异。推测可能与此类患者在治疗前1次或多次二期梅毒复发有关，虽经正规抗梅毒治疗，但体内多克隆免疫记忆B细胞仍发挥作用。这一现象值得进一步深入研究。

梅毒治疗后疗效的评估标准为临床治愈和血清治愈。临床治愈评估主要是通过正规治疗后控制炎症，消除损害。血清治愈评估是指梅毒正规治疗后首次RPR试验效价有4倍下降，并在规定时间内血清抗体阴转。如治疗后3个月血清抗体效价没有2个稀释度(4倍)下降或2个稀释度(4倍)上升，应予复治[5]。现尚无文献报道患者治疗与血清阴转所需时间的关系。有关梅毒患者治疗后血清抗体的变化情况，许多学者[6,7]开展了感染与免疫学机制的研究，认为梅毒患者治疗后血清抗体变化与T细胞数量变化和血清固定存在一定关系，这些结论用于指导临床治疗和疗效评估仍比较困难。龚匡隆等[8]认为梅毒血清试验的各种方法敏感度存在差异。与TP-IgM ELISA同类的19S IgM-TPPA可用于梅毒的早期诊断，但不能用于治疗后二期梅毒的判愈。本研究采用TP-IgM ELISA和RPR试验对正规治疗12个月后的早期梅毒患者血清抗体进行观察，仅有一期梅毒患者血清全部阴性，二期梅毒分别有35.5%和32.3%血清阳性，早期潜伏梅毒患者血清阳性率仍达56.3%。在临床随访中，这些梅毒患者并无症状和体征表现，HIV试验阴性，RPR试验和TP-IgM ELISA仍阳性的因素是否与治疗时间、自身免疫功能和随访时间相关，值得今后加强研究。

综上所述，梅毒血清RPR试验、TPPA和TP-IgM ELISA这3种方法对未治疗梅毒患者的诊断，RPR试验和TP-IgM ELISA阳性；TPPA也阳性，且对早期潜伏梅毒的敏感性强，较RPR试验和TP-IgM ELISA诊断率高。对正规治疗后的梅毒患者随访，TP-IgM ELASA阴性，RPR试验基本上也阴性，表明RPR试验与TP-IgM ELASA结果一致，可以价廉物美的RPR试验用作随访。因此，TPPA和RPR试验最适合分别用于梅毒常规诊断和随访。

[1] 龚匡隆，尤永燕，邵长庚.梅毒血清学试验的内部质量控制[J].中国皮肤性病学杂志，1997，11(1)：31-33.

[2] 龚匡隆，尤永燕，邵长庚.一期梅毒患者梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验的检测[J].中华皮肤科杂志,2001,34(3):231.

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[5] 王千秋，张国成主编.性传播疾病临床诊疗指南[M].上海：上海科学技术出版社，2007，2-16.

[6] 刘隽华，韩建德，陈木开，廖琦曼，陈小红. 梅毒血清固定者与治疗后阴转者的免疫功能比较研究[J].中国艾滋病性病， 2008, 14(14): 385-386.

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[8] 龚匡隆, 张津萍, 沙仲, 尤永燕, 孙厚华, 邵长庚. 19S IgM-梅毒螺旋体明胶凝集试验对梅毒患者的诊断和随访研究[J]. 中华皮肤科杂志, 2000, 33(3): 175.