2009流行性感冒患者血清细胞因子的变化特点

毛会军，陈良，沈芳

上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心，上海 201508

2009年3月墨西哥暴发2009甲型H1N1流行性感冒(简称流感)后，全球多个国家相继出现疫情。2009年6月11日世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将流感大流行警告级别提高至6级。我国卫生部也将其纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，依照甲类传染病采取预防、控制措施。本研究检测了30例确诊2009甲型H1N1流感患者治疗前的血清细胞因子水平，并通过与健康对照者进行比较，初步探讨2009甲型H1N1流感易感人群血清细胞因子的变化及其可能的发病机制，同时检测经奥司他韦治疗后患者血清细胞因子的变化情况。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2009年5月25日～2009年7月13日于上海市公共卫生临床中心确诊的2009甲型H1N1流感患者30例，其中男18例、女12例；年龄10～45岁，平均25岁；均口服抗病毒药物奥司他韦，75 mg/次，每日2次，疗程5 d。为观察药物对血清细胞因子的影响，将服药前所采血样作为治疗前组，服药后第3天所采血样作为治疗后组。采血时间为上午6∶00～8∶00。

诊断标准参照卫生部颁发的《甲型H1N1流感诊断治疗方案(2009试行版第1版)》[1]，排除存在血液病史、免疫系统病史及其他疾病者。同时选择健康体检者20例作为对照，其中男8例、女12例；年龄14～43岁，平均27岁。

1.2 标本采集及病原学检测

采集患者咽拭子标本，送上海市疾病预防控制中心进行病毒核酸检测。实验室诊断标准：甲型流感病毒通用M基因阳性，猪H1N1流感病毒通用NP基因阳性，甲型H1N1流感病毒特异HA基因阳性。

1.3 血清细胞因子检测方法及原理

患者均于入院后第1天、经奥司他韦治疗第3天采血，3 500g离心10 min，分离血清，-20 ℃保存待检。使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)检测白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)、IL-2、IL-8、γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)水平。原理为双抗体夹心ELISA，在450 nm处读取A值，浓度与A450值成正比。所有实验严格按照试剂盒操作步骤操作，酶标仪为Thermo公司的MK3型。为避免实验结果受曲线拟合的影响，直接采用A值。

1.4 统计学方法

治疗前、后组与对照组比较，均采用独立样本t检验；治疗前、后组比较，采用配对t检验。

2 结果

30例患者口服奥司他韦治疗后均恢复良好。

2.1 患者血清中IL-10变化

治疗前组血清IL-10平均A值为0.386±0.717，治疗后组平均A值为0.323±0.688，而对照组平均A值仅为0.040±0.010。与对照组比较，治疗前、后组血清IL-10水平均显著增高(P<0.05)。而治疗前、后组血清IL-10水平无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表12009甲型H1N1流感患者治疗前后血清IL-10、IL-2和IFN-γ水平与健康者比较(A450值)

Tab.1IL-10,IL-2andIFN-γserumlevelsinhealthyindividualsandinfluenzavirusA/H1N1/2009-infectedpatientsbeforeandaftertreatment(A450value)

Control group (n=20)Before treatment group (n=30)After treatment group (n=30)IL-100.040±0.0100.386±0.717a0.323±0.688aIL-20.262±0.0150.518±0.685a0.378±0.484 a,bIFN-γ0.041±0.0100.111±0.179a0.074±0.094b

aP<0.05vscontrol group;bP<0.05vsbefore treatment group.

2.2 患者血清中IL-2变化

对照组血清IL-2平均A值为0.262±0.015，治疗前组平均A值为0.518±0.685，治疗后组平均A值为0.378±0.484。治疗前组血清中IL-2水平显著高于对照组，但经药物治疗后迅速下降。与对照组比较，治疗前、后组血清IL-2水平均显著升高 (P<0.05)，但治疗后组血清IL-2水平较治疗前组显著降低(P<0.05)(表1)。

2.3 患者血清中IFN-γ变化

对照组血清IFN-γ平均A值为0.041±0.010，治疗前组平均A值为0.111±0.179，治疗后组平均A值为0.074±0.094。与对照组相比，治疗前组血清IFN-γ水平显著升高(P<0.05)，但治疗后组与对照组无统计学差异(P>0.05)。治疗后患者血清IFN-γ水平较治疗前显著降低(P<0.05)(表1)。

2.4 患者血清中IL-8变化。

对照组血清IL-8平均A值为0.130±0.082，治疗前组平均A值为1.026±1.112，治疗后组平均A值为1.953±1.291。与对照组相比，治疗前、后组血清IL-8水平显著升高(P<0.01)。治疗后患者血清IL-8水平较治疗前显著升高(P<0.01)(表2、图1)。

表22009甲型H1N1流感患者治疗前后血清IL-8水平与健康者比较(A450值)

Tab.2IL-8serumlevelsinhealthyindividualsandinfluenzavirusA/H1N1/2009-infectedpatientsbeforeandaftertreatment(A450value)

Control group (n=20)Before treatment group (n=30)After treatment group (n=30)IL-80.130±0.0821.026±1.112a 1.953±1.291a,b

aP<0.01vscontrol group;bP<0.01vsbefore treatment group.

CG, control group; BTG, before treatment group; ATG, after treatment group.

图12009甲型H1N1流感患者治疗前后血清IL-8水平与健康者比较(A450值)

Fig.1ComparisonofIL-8serumlevelsinhealthyindividualsandinfluenzavirusA/H1N1/2009-infectedpatientsbeforeandaftertreatment(A450value)

3 讨论

1918年甲型流感病毒大流行，导致近千万人死亡。至今人类仍旧无法有效控制流感病毒，可能与病毒本身突变有关，也可能与其能在人与动物间传播并发生重组，且无法消除动物储存源有关。2009年3月墨西哥暴发的2009甲型H1N1流感是由变异的新型甲型H1N1流感病毒引起的急性呼吸道传染病。2009甲型H1N1流感病毒属正黏病毒科甲型流感病毒属，为单股负链RNA病毒，基因组约为1 316 kb, 由大小不等的8个独立片段组成[2]。2009甲型H1N1流感属于新发疾病，我们前期研究结果提示，2009甲型H1N1流感患者外周血T细胞亚群CD3+T细胞﹑CD4+T细胞和CD8+T细胞均较对照组显著降低[3]。

流感病毒侵入机体后，刺激机体产生一定的免疫反应，从而对机体的细胞因子分泌产生一定影响。在本研究中，30例2009甲型H1N1流感患者治疗前、后的血清细胞因子水平与对照组比较：治疗前血清IL-10、IL-2、IL-8和IFN-γ水平均显著升高。经奥司他韦治疗后3 d，患者血清IL-10、IL-2、IL-8水平仍较对照组显著升高；而IFN-γ水平变化不显著。治疗前、后组比较：IL-10水平变化不显著，IL-2和IFN-γ治疗后显著降低，IL-8治疗后却显著升高。结果提示，2009甲型H1N1流感患者血清细胞因子水平异常。本结果与某些国外研究报道相似，如Nakajima等对因2009甲型H1N1流感死亡患者尸检发现，其血清与肺组织中IL-10、IL-6、IL-2受体(IL-2 receptor, IL-2R)、IFN-α、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和IFN-γ诱导的单核因子(monokine induced by interferon γ，MIG)水平均升高[4]。de Jong等研究发现，H5N1流感重症患者和死亡病例与高细胞因子血症存在一定关联[5]。印度学者研究发现，2009甲型H1N1流感患者疾病严重程度与其血浆中IL-1R拮抗剂(IL-1 receptor antagonist，IL1RA)、IL-2、IL-6、巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α/CCL3)、巨噬细胞炎性蛋白-1β(macrophage inflammatory protein-1β，MIP-1β/CCL4)和 IL-10升高呈正相关[6]。Kawashima等报道的2例2009甲型H1N1流感患者重症病例，一例肺炎合并纵隔气肿和严重低氧血症，另一例肺炎合并脑病，两者早期肺分泌物中均有高水平的IL-8、MCP-1 和MIP-1β。住院5 d后，其IL-1β 、IL-6、IL-10、IL-17、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、IFN-γ、MCP-1 和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)明显增加[7]。

IL-8是一种具有趋化活性的细胞因子，能够诱导中性粒细胞定向迁移[8]，增加炎症反应。体外研究发现，在2009甲型H1N1流感前期，支气管上皮细胞NCI-H292表达的IL-6和IL-8在mRNA和蛋白水平升高不明显，但在感染后期均明显升高[9]。Hagau等研究发现，血清IL-8水平在2009甲型H1N1流感引起急性呼吸窘迫综合征患者中显著升高，轻症患者升高不明显，但肥胖患者中IL-8水平升高更明显[10]。2009甲型H1N1流感住院患者血清IL-8和IL-13水平较对照组和门诊患者显著升高[11]。我们前期研究表明，2009甲型H1N1流感患者白细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞无明显变化，中性粒细胞和单核细胞明显偏高[3]。本研究中，2009甲型H1N1流感治疗前、后组患者IL-8水平均较对照组显著升高，且治疗后组比治疗前组升高更显著。这一现象提示，在2009甲型H1N1流感患者体内，中性粒细胞显著升高可能与IL-8水平升高有关，而IL-8可能与奥司他韦抗病毒机制有一定关系。

IFN-γ和IL-8有促进抗病毒免疫作用，同时通过募集中性粒细胞和单核细胞引起呼吸道部位的炎症反应[12]。IFN-γ和IL-12在猪流感病毒的发病机制中起一定作用，可诱导急性反应蛋白的产生[13]。在北美猪流感病毒感染的猪血清中，IFN-γ水平升高并不明显[14]。本研究中，2009甲型H1N1流感治疗前组IFN-γ水平较对照组显著升高，这与A/Texas/36/1991 (H1N1)感染患者鼻腔冲洗液中IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α均较对照组显著升高的结果类似[15]。治疗后组与对照组比较，IFN-γ水平变化不显著，但较治疗前组显著降低。此现象与Hagau等报道一致[10]。这些结果表明，IFN-γ可能与2009甲型H1N1流感的致病性有关；也可能与奥司他韦抗病毒机制有关。

IL-2主要由激活的CD4+T细胞产生，CD8+T细胞产生量较少，是T细胞自分泌和旁分泌细胞因子，主要生物学活性是刺激靶细胞增殖，增强靶细胞的辅助或杀伤功能，并可诱导杀伤细胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子。IL-2是驱动颗粒酶B表达和穿孔素介导细胞裂解过程的必要细胞因子[16]。血清IL-1β、IL-2、IL-4和MCP-1水平在2009甲型H1N1流感合并严重肺炎的患儿中比合并轻度肺炎患者显著升高[17]。本文研究数据显示，2009甲型H1N1流感治疗前、后组患者血清IL-2水平均较对照组显著升高，而治疗后组较治疗前组显著降低。结果表明，IL-2可能参与2009甲型H1N1流感发病机制，同时可能是参与奥司他韦抗病毒机制的细胞因子之一。

IL-10是一种重要的抗炎细胞因子。病毒感染早期，IL-10的产生是机体控制和限制病毒感染所致炎症的重要机制之一[18]。IL-10 主要抑制IL-12和IFN-γ分泌，从而促进辅助T细胞(helper T cell，Th细胞)2型分化，而且它是B细胞终分化因子。在B细胞对抗流感病毒抗原时，IL-10起关键作用，有助于在感染中和感染后产生保护性抗体。McKinstry等在小鼠模型中研究发现，流感时IL-10抑制Th-17免疫反应且与保护机制相关[19]。2009甲型H1N1流感住院患者血清IL-10水平较对照组和门诊患者显著升高[11]。2009甲型H1N1流感合并肺炎患者血清 IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13和MCP-1较未合并肺炎者显著升高[17]。但Kawashima等报道的2例2009甲型H1N1流感患者重症病例中，肺分泌物中IL-4均在正常水平，而合并脑病患者IL-10在入院5 d后明显升高[7]。本研究结果表明，2009甲型H1N1流感治疗前、后组患者血清IL-10水平均显著高于对照组，但治疗前、后组之间血清IL-10水平变化无显著差异。IL-10可能也参与2009甲型H1N1流感的发病机制。

本文初步结果显示，人感染2009甲型H1N1病毒后，外周血清中IL-10、IL-2、IL-8和IFN-γ均显著升高；治疗后由T细胞亚群产生的IL-10、IL-2和IFN-γ均显著降低或无变化，而单核-巨噬细胞产生的IL-8却显著升高，是否与单核-巨噬细胞吞噬病毒有关，值得进一步研究。另外，我们发现2009甲型H1N1流感患者治疗前、后血清细胞因子水平个体差异较大，提示在后续研究中，应该适当增加样本量；选用多种细胞因子检测方法，如核酸检测、生物活性检测等。

本文不足之处是检测时间点不足，未能作完全动态观察。如能在治疗前，治疗后第1天、第3天、第6天采血测定细胞因子水平，就能深入了解人感染2009甲型H1N1流感病毒后外周血清中细胞因子水平的动态变化。

综上所述，本研究结果推测：IL-10、IL-2、IL-8和IFN-γ可能与2009甲型H1N1流感的发病机制有关；IL-2、IFN-γ和IL-8可能参与奥司他韦的抗2009甲型H1N1流感作用。

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