上海地区人类免疫缺陷病毒1型感染者原发耐药基因及亚型分析

刘莉，马建新,郑毓芳 ,张仁芳，沈银忠，李莉，陈军，王珍燕，孙富艳，卢洪洲，2，3

1．上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心感染科，上海 201508； 2. 复旦大学附属华山医院感染科，上海 200040； 3． 复旦大学上海医学院内科学系，上海 200032

从1981年美国报道第1例艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)至今，人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)已夺去数千万人的生命，成为威胁全人类的重大传染病之一[1]。HIV反转录酶缺乏校正功能，导致HIV易产生基因突变[2]。目前全球已发现多种基因亚型和重组体病毒株。随着对外开放及交流增多，我国已成为世界上HIV亚型流行最多的国家之一。上海作为国际大都市，外来人口多，人口流动性大，HIV/AIDS患者逐年增加。目前上海地区接受抗反转录病毒治疗(antiretroviral therapy，ART)的患者近900人。虽然ART的广泛应用大大降低HIV/AIDS患者的发病率和病死率，但也导致感染人群中HIV耐药毒株的感染率逐渐增加，这些耐药毒株正向普通人群传播。据报道，欧美等国家原发耐药的发生率已达20%以上。HIV耐药是抗病毒治疗失败的重要原因之一，是目前抗病毒治疗面临的重大难题。在我国也出现有关未接受抗病毒治疗的病例中存在耐药毒株的报道，给临床治疗药物的选择带来巨大挑战。本研究的目的是了解上海地区未接受抗病毒治疗的HIV/AIDS患者中HIV亚型分布及耐药基因变异情况，为HIV的防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

118例未接受过抗HIV治疗的HIV/AIDS患者均为上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心门诊或住院病例，经上海市疾病预防控制中心实验室蛋白免疫印迹(Western blot)法确认为HIV-1感染。

1.2 标本采集

2008年10月～2009年10月，采集乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝的HIV/AIDS患者外周血，经离心分离血浆，分装后-80 ℃冻存。

1.3 T细胞亚群检测

采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪进行CD4+、CD3+及 CD8+细胞计数，结果用Multiset软件自动分析。

1.4 基因亚型和耐药位点突变分析

1.4.1血浆HIV-1RNA提取使用法国生物梅里埃公司的全自动核酸提取仪NucliSENS® easyMAG®提取RNA。

1.4.2HIV-1RNA套式反转录-聚合酶链反应反转录合成cDNA，引物为RT-21(5′-CTGTA-TTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3′)，所得cDNA作为套式反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)模板。第1轮反应引物分别为MAW-26 (5′-TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3′)和RT-21(5′-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTT-TGATGGG-3′)。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min；10 ℃保存。生成产物为第2轮PCR模板。第2轮反应引物分别为PRO-1 (5′-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3′ )和RT-20 (5′-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3′)。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min；10 ℃保存。反应所需引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.4.3电泳1%西班牙琼脂糖(biowest agrose)凝胶电泳：每个样本5 μl，使用250 bp DNA梯度对照(TaKaRa)，电泳条件为100 V、40 min，PCR扩增产物片段约1.3 kb。电泳结果经凝胶成像仪拍照后存档。

1.4.4PCR扩增产物纯化和核苷酸测序PCR扩增产物由上海生物工程技术服务有限公司纯化和测序。

1.4.5序列亚型分析使用BioEdit、ClustalX等软件进行序列校对、整理和比对分析，使用斯坦福REGA HIV亚型分型工具〔REGA HIV-1 Subty-ping Tool (Version 2.0)，http://dbpartners.stanford.edu/RegaSubtyping〕和美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)HIV亚型分析工具(NCBI HIV Subtyping Tool，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)分析亚型。使用MEGA 4.0，以邻位连接法绘制系统进化树。用Bootscaning法(SimPlot 3.2软件)进行序列特征和重组位点分析。选取的参考株为HIV-1 CRF01_AE(90CF11697，GenBank序列号AF197340)、B基因亚型(WEAU160，GenBank序列号U21135)和C基因亚型(BR025，GenBank序列号U52953)。

1.4.6耐药性分析应用美国斯坦福大学HIV耐药数据库(Stanford HIV Drug Resistance Database，http://hivdb.stanford.edu/)进行耐药性分析。

1.5 统计学处理

应用统计分析软件SPSS13进行数据分析。

2 结果

2.1 研究对象基本情况

118例HIV/AIDS患者中，男110例(93.2%)，女8例(6.8%)；平均年龄(38.5±12.5)岁。感染途径主要为性接触92例(78.0% )，其余分别为输血感染(3例，2.5%)、静脉吸毒感染(2例，1.7%)、有偿献血感染(1例，0.8% )和不明原因感染(20例，17.0%)。CD4+细胞直接计数5～610/μl，平均176/μl。

2.2 HIV-1 基因亚型分布

根据pol基因区序列进行HIV-1基因亚型分析，使用斯坦福REGA HIV亚型分型工具、NCBI HIV 亚型分析工具及HIV BLAST(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html)综合分析确定亚型和重组体，结果CRF01_AE重组体57例(48.3%)、B亚型36例(30.6%)、CRF07_BC 15例 (12.7%)、CRF08_BC 7例(5.9%)、C亚型2例(1.7%)。1例综合以上分析，依然不能确定亚型，但SimPlot软件分析结果为B/CRF01_AE(图1)。其中2例(cnsh4015、cnsh4150)斯坦福REGA HIV亚型分析为A1亚型，但NCBI HIV亚型分析及HIV BLAST提示更倾向于CRF01_AE重组体。通过基因进化树分析，发现CRF01_AE重组体聚集在一起，将其归为CRF01_AE亚型(图2)。性传播现在已成为我国HIV的主要传播途径，各种亚型均有，2例输血及1例献血患者感染B亚型，1例输血患者感染CRF07_BC，2例静脉吸毒患者均感染CRF01_AE重组体。

图1 SimPlot Bootscaning 分析结果

2.3 基因进化树分析

应用MEGA 4.0软件对所有序列构建进化树，所用参考序列见图2。118份pol基因序列中，各型均与其标准序列聚集在一起。B/CRF01_AE二重重组体(编号cnsh7003)大部分序列以CRF01_AE为主，从进化树上可以看出与CRF01_AE组聚集在一起，但位于CRF01_AE组的边缘。cnsh7003与B亚型组之间距离0.0081，与CRF01_AE组之间距离0.0532。

图2118例HIV-1阳性感染者pol基因分布情况

Fig.2polgeneof118HIV-1-positivepatients

2.4 HIV-1耐药相关基因突变

整理后的pol序列提交斯坦福大学HIV耐药数据库进行耐药突变分析，发现耐药相关突变发生率较高(64/118)。19例出现核苷酸反转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitor， NRTI)耐药突变，突变位点分别为M41L(0.8%，1/118)、D67N(0.8%，1/118)、T69I/N/S(4.2%，5/118)、K70L(0.8%，1/118)、L74V(0.8%，1/118)、V75L(2.5%，3/118)、V118I(0.8%，1/118)、M184V(0.8%，1/118)、L210W/F/M/S(3.4%，4/118)和T215F(0.8%，1/118)。37例发生非核苷酸反转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI)耐药突变，突变位点分别为V90I(1.7%，2/118)、L100V(0.8%，1/118)、K103R/N(4.2%，5/118)、V106M/P/I/G(8.5%，10/118)、E138G/A(2.5%，3/118)、V179E/D/T(8.5%，10/118)、Y181C(0.8%，1/118)、G190A(0.8%，1/118)、H221Y(0.8%，1/118)、F227L(0.8%，1/118)、K238S(0.8%，1/118)和Y318F(0.8%，1/118)。蛋白酶(protease, PR)区蛋白酶抑制剂(protease inhibitor，PI)主要突变者5例，突变位点分别为M46L(1.7%，2/118)、L33F(0.8%，1/118)、V32L(0.8%，1/118)和I54F(0.8%，1/118)；PI次要突变者18例，突变位点分别为L10I(8.5%，10/118)、A71T(2.5%，3/118)、A71V(2.5%，3/118)、Q58E(0.8%，1/118)和T74S(0.8%，1/118)。118例样本中，2例同时存在PI次要、NRTI和NNRTI突变位点，3例同时存在PI次要和NNRTI突变位点，1例同时存在PI次要和NNRTI突变位点，7例同时存在NRTI和NNRTI突变位点。118例中，7例出现对HIV-1抗病毒药物不同程度的耐药，耐药发生率为5.9%(7/118)。HIV-1耐药发生情况及其在不同亚型中的分布见表1。

3 讨论

HIV-1的反转录酶缺乏校正功能而易发生复制错误，因此在复制过程中易产生大量点突变或插入/缺失突变从而发生重组，形成大量亚型内或亚型间重组毒株[3]。目前世界上已发现9种HIV-1基因亚型和16种重组体病毒株，我国是世界上亚型流行最多的国家之一[4]。本研究显示，上海地区主要流行株是CRF01_AE重组体，其次为B亚型，还有其他一些亚型，与上海地区的其他研究基本相符[5-7]。CRF01_AE和B亚型是上海地区的主要流行株。有报道[8]已出现B/CRF01_AE二重重组体，本研究也发现B/CRF01_AE二重重组体。基因重组能产生大量变异类型，重组后的病毒基因组中含有来自不同亲本的基因，可能改变重组毒株的遗传特性和生物学表型，提高病毒适应能力。有研究表明，HIV重组体毒株是多种毒株混合感染及在复杂的免疫环境中优势选择的结果，较单一基因亚型毒株有更强的传播能力[9]。本研究中单一亚型感染率为32.2%(38/118)，显著低于重组体毒株(P<0.01)，说明HIV重组体具有更强的传播能力，因此应加强此类重组体流行的监测。

通过基因进化树发现，既有源自泰国的B’亚型，也有源自美国的B亚型，CRF01_AE组内也分多个进化簇分别聚集在一起。说明上海地区不仅亚型或重组体传播较多，而且亚型中存在较多变异，这些变异毒株还存在一定范围的传播。

ART是抑制HIV感染者病毒数量、改善生命质量和延长预期寿命的有效手段，病毒耐药是ART治疗失败的主要原因之一。但HIV感染宿主后，每天以107～108次的速度进行病毒复制；同时由于HIV反转录酶缺乏校读功能，造成复制产物中存在碱基错配，导致病毒变异，在药物压力下很容易出现基因突变。因此，由基因突变产生耐药导致抗病毒治疗失败的情况屡有发生。在一些国家，对目前世界卫生组织推荐的一线药物组合耐药的比率已>10%[10]。随着“四免一关怀(中国艾滋病免费治疗政策)”的开展，我国越来越多的HIV/AIDS患者得到抗病毒治疗；但HIV耐药毒株的发生率逐渐增多，耐药毒株的传播也逐渐增加。本研究发现，耐药相关突变发生率较高，达54.2%(64/118)，且118例患者中7例出现对HIV-1抗病毒药物不同程度的耐药，耐药发生率为5.9%(7/118)，另外12例(10.2%)出现潜在低度耐药。

本研究还发现2例针对PI类药物的耐药突变株、3例潜在耐药毒株，另外17例样本存在PI突变。M46L、L33F等突变位点是PR基因功能的主要位点，在对PI耐药的产生中起重要作用。有研究发现，PI主要突变能降低病毒对PI类药物的敏感度，而次要突变会增强病毒对周围环境改变的适应能力，如校正原发突变导致的复制缺陷。但主要和次要突变同时出现时，会加速耐药的产生[11]，如M46L合并其他变异时会对IDV/r、NFV、FPV/r、LPV/r等多种PI类药物产生耐药。福建、浙江等省的研究也发现，在PR区M46L等位点存在M46L变异，但没有发现耐药毒株。本研究发现PI主要突变和次要突变同时存在，说明我国虽然PI使用时间不长，但已在未经抗病毒治疗的HIV感染者中发现PI耐药毒株，如果不重视HIV治疗的合理规范，将来可能会产生更严重的后果。

表1上海地区HIV-1感染者耐药发生情况及其在不同亚型中的分布

Tab.1Drugresistanceandresistance-associatedmutationsof118HIV-1-positivepatientsinShanghai

SamplecodeSubtypePI resistanceMutationDrugresistanceNRTI resistanceMutationDrugresistanceNNRTI resistanceMutationDrugresistancecnsh2436BD67N, M184V, T215FHR: 3TC FTCIR: ABCAZTD4TDDIV106M, G190A, F227LHR: DLVEFVNVPIR:ETRcnsh2029BM41L, T69N, L74VHR: DDIIR: ABCLR: D4TPL: AZTTDFK103N, Y181C, H221YHR: DLVEFVNVPIR: ETRcnsh4133CRF01_AEV179D, Y318FHR: DLVIR: NVPLR: EFVETRcnsh4003CRF01_AEPI major:M46LIR: NFVPL: ATV/rFPV/rIDV/rLPV/rcnsh5065CRF07_BCPI minor:Q58ELR: TPV/rcnsh2102BL210WLR: AZTD4TPL: ABCDDITDFV90I, K103Rcnsh2070BE138G, V179ELR: DLVEFVETRNVP

HR, high-level resistance; IR, intermediate resistanc; LR, low-level resistance; PL, potential low-level resistance; PI major: protease inhibitor resistance-associated major mutation; PI minor, protease inhibitor resistance-associated minor mutation.

反转录酶区的耐药突变分为NRTI和NNRTI。NRTI相关耐药突变位点有5类：①胸苷相似体突变(thymidine analog mutation，TAM)，主要位于41、67、70、210、215和219位点。②TAM相关突变(TAM-associated mutation)。当第44、69、75、118位突变与TAM同时存在时将对NRTI产生耐药。③Q151M突变复合体。④K65R突变。⑤M184V突变。在本研究中，NRTI耐药突变19例，占16.1%(19/118)。NNRTI主要耐药位点为第103、106、181、188及190。本研究中NNRTI耐药突变37例，占31.4%(37/118)。以上研究提示，基本上全部反转录酶耐药突变位点都存在，耐药突变相关位点的积累会提高病毒对药物选择压力时的适应性和复制水平，有利于耐药毒株的产生和传播。另外通过对比发现，NNRTI的耐药变异位点和频率比NRTI多，可能NNRTI更易产生耐药变异。

本研究中HIV-1感染者耐药性和亚型分析结果显示，上海地区HIV-1毒株以CRF01_AE重组体为主，且已出现二重重组体和原发高度耐药毒株。耐药情况不容乐观，应对HIV-1耐药毒株的疫情蔓延提高警惕，加强宣传教育，并进一步加强对HIV-1基因亚型和耐药毒株的监测。

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