对1株疑似鼠疫耶尔森氏菌的系统鉴定

何 建,李艳君,祁芝珍,崔玉军,任玲玲,代瑞霞,王效义,崔百忠,张青雯,杨瑞馥,宋亚军

鼠疫是一种严重危害人类健康的人兽共患病。鼠疫菌是鼠疫的病原体,为革兰阴性菌,属于肠杆菌科的耶尔森氏菌属。比较基因组学研究表明,鼠疫菌在大约1 500-20 000年前由假结核耶尔森氏菌(以下简称假结核菌)进化而来[1-2]。作为一个相对“年轻”的病原细菌,鼠疫菌的生物学特征以及基因组结构均与其“祖先”—假结核菌极为相似。

在我国鼠疫防治实践中,“四步检验”(形态、镜检、噬菌体裂解以及动物实验)一直都是鼠疫菌鉴定的“金标准”[3]。而由于动物实验的成本较高,周期较长,噬菌体裂解实际上成为许多一线鼠疫防治机构进行鼠疫菌鉴定的重要依据。2005年,我们在进行菌株冻干入库前的动物试验时发现菌株55023能够被鼠疫噬菌体裂解,但是不能导致实验动物的死亡。因此,我们对该菌株进行了系统的表型和分子生物学鉴定,以确定其是否为鼠疫菌。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 被试菌株55023,对照菌株为鼠疫菌标准株 141、91001、82009,以及假结核菌 Ⅰ型 5号(PTB),由青海省地方病预防控制所鼠疫菌保藏中心提供;染色体DNA均用传统的苯酚-氯仿法提取。

1.2 实验动物 昆明系小白鼠体重18～20g,由青海省实验动物中心提供。

1.3 主要试剂及仪器 鼠疫噬菌体、各类鉴定培养基均由青海省地方病预防控制所鼠疫室提供。鼠疫菌FI抗原、抗体检测试剂由北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司提供。TaqDNA聚合酶和dNTP购自大连 TaKaRa生物技术公司;GoldviewTMDNA染料由赛百盛公司提供;PCR扩增在MJ-25全自动PCR仪上完成。

1.4 引物 各项基因检测用引物均由军事医学科学院微生物流行病研究所提供,引物序列详见表1。

1.5 鼠疫噬菌体裂解试验 被试株55023和对照株141、PTB划线接种于固体培养基,滴加鼠疫噬菌体,使其流过划线区域,将培养皿分别置于22℃、28℃、37℃过夜培养,观察有无噬菌现象;以鼠疫菌141菌株和假结核菌PTB为对照。

1.6 生化及糖醇类酵解试验 按常规试管法[4]对55023菌株进行阿胶糖、鼠李糖、麦芽糖、脱氮、蜜二糖、甘油等生化试验,观察14d。

1.7 毒力因子检查及结果判定 按常规法[5]测试55023菌株的 F1抗原(F1),VW抗原(VW),色素沉着表型(Pgm)以及鼠疫菌素(Pst I)等毒力因子表型。

1.8 动物实验 按 50、100、150、200、250、300、350亿个菌/mL设置剂量组,每组5只动物,鼠鼷部皮下接种0.5 mL,分笼饲养观察14d,若动物死亡,取其肝、脾、肺、心、腺均进行细菌培养,14d后仍未死亡的实验动物全部处死,观察病理变化,每只动物均取肝、脾、肺、心、腺进行细菌培养,并利用胶体金试剂盒进行鼠疫抗原和鼠疫抗体检查[6]。

表1 基因检测用引物及序列Table 1 The sequences of primers for gene validation

1.9 鼠疫菌全基因组芯片杂交 以55023菌株DNA为测试方,以91001和82009菌株DNA的等量混合物为参考方,进行全基因组芯片杂交分析,方法参见文献[7]。

1.10 PCR扩增 用鼠疫菌标识基因[8]、质粒检测基因、色素沉着位点pgm代表性基因的特异引物对该菌株DNA进行扩增(表1),以91001菌株作为阳性对照,同时设置阴性对照。扩增条件为:95℃预变性3min,30个循环(95℃变性40s,56℃复性40s,72℃延伸60s),72℃终延伸5min。产物1.5%琼脂糖凝胶电泳,GoldviewTM染色,紫外灯下记录结果。

1.11 鼠疫菌差异片段(Different Region,DFR)分型 用23对DFR(DFR01-DFR23)分型引物[9],对该株菌样品DNA进行分型验证,以91001、82009菌株DNA的等量混合物为阳性对照,同时设置阴性对照。

1.12 多位点序列分型(Multi-Locus Sequence Typing,MLST)分析 根据文献[1],选择dmsA,glnA,manB,thrA,tm K,trp六个看家基因的特异引物对该菌株进行扩增,产物测序后进行序列比对分析。

2 结 果

2.1 培养特性和镜下形态 55023菌株培养于普通营养琼脂培养基,28℃、37℃培养24h后生长良好;肉眼观察呈灰色小菌落,低倍显微镜下可见菌落中央为黄褐色,有粗糙颗粒,边缘有薄而透明、锯齿状花边;与典型的鼠疫菌形态无显著性差异。55023菌株革兰氏染色阴性,镜下呈两端钝圆,两极浓染的短小杆状 ,长约 1～2μm,宽约 0.5～0.7μm,无鞭毛,无芽孢;具备典型的鼠疫菌镜下形态。

2.2 鼠疫噬菌体裂解试验 55023菌株和141菌株在22℃、28℃以及37℃不同的培养温度下,均能被鼠疫噬菌体完全裂解,呈清晰的噬菌带;而假结核菌参考菌株PTB在3个温度下均无噬菌带。

2.3 生化特性和毒力因子 55023的主要代谢表型为,阿胶糖(+),鼠李糖(-),麦芽糖(+),蜜二糖(-),甘油(+),脱氮(+),与鼠疫菌141菌株特征完全一致。其毒力因子表型为F1(-),VW(-),Pgm(-),PstⅠ(-),四个毒力因子均为阴性,不符合鼠疫菌的特征。

2.4 动物实验 55023菌株接种小白鼠后,14 d内所有剂量组共计35只小白鼠均无死亡;14 d后全部处死,实验动物脏器中未看到有明显病理变化,取肝、脾、肺、心、腺均做细菌培养,结果为阴性;利用鼠疫胶体金试剂盒未检测到鼠疫菌FI抗原和抗体。

2.5 鼠疫菌全基因组芯片杂交 全基因组芯片杂交结果表明,在4 105个测试的基因中,55023菌株基因组中缺失了489个基因,约占芯片所有基因的12%。其中鼠疫菌的 3个质粒(pPCP,pCD和pMT1)全部缺失,染色体上缺失的主要基因片段有YPO2087-2135、YPO0685-0778、YPO0980-1012 及YPO2271-2281等。

2.6 PCR扩增结果 该菌株用鼠疫菌标识基因YPO0392和 YPO1091的特异引物扩增结果为阴性,对于鼠疫菌质粒的6个基因,该株菌样品均无扩增产物,pgm位点的代表基因 YPO1954扩增阳性,而 YPO1908扩增阴性,以上扩增反应对照菌株91001的DNA均有预期产物,空白对照成立。

2.7 DFR分型 结果见表 2,在 23个 DFR中55023菌株缺失了14个,检索包含900余株鼠疫菌自然分离菌株的DFR分型数据库[9],未发现与其一致或相类似的基因组型。

表2 55023菌株的DFR分型结果Table 2 The DFR profiles of strain 55023

2.8 MLST结果 测序的6个看家基因片段共2,509 bp,经检索NCBI GenBank数据库,55023菌株与鼠疫菌的序列共存在16个碱基的差异,而与假结核菌血清Ⅲ型 IP32937菌株仅存在两个碱基的差异,其中4个基因完全一致,详见表3。

3 讨 论

噬菌体裂解试验是原鼠疫诊断国家标准(GB15991-1995)中病原学检测的重要内容。从自然界分离的某些假结核菌能够在37℃或30℃被鼠疫噬菌体裂解,但是在20～22℃不被裂解,这种温度特异性裂解是利用鼠疫噬菌体进行鼠疫菌鉴定的基础。由于其操作简单,特异性比较理想,在缺乏动物实验和分子生物学手段的情况下,鼠疫噬菌体裂解试验实际上已成为一线鼠疫防治机构进行鼠疫菌鉴定的“最终标准”。本文所报道的55023菌株在22℃、28℃、37℃不同的温度下,均能被鼠疫噬菌体完全裂解,与鼠疫菌的表现完全一致;从其他表型上看,55023菌株也有一些鼠疫菌的特征。

表3 55023菌株的MLST结果Table 3 MLST results for strain 55023

然而一系列基于核酸的实验结果表明,55023菌株缺失了大量的鼠疫菌基因(约12%),包括鼠疫菌的三个典型质粒,及部分染色体基因(如pgm位点不完整),其所对应的菌株基因组结构与鼠疫菌存在较大差异[7]。55023菌株中缺失了14个DFR,该菌的DFR谱不同于任何鼠疫菌自然分离菌株[9],进一步说明该菌株不具备鼠疫菌典型的基因组结构。用两个位于染色体上的鼠疫菌标识基因引物[8]扩增55023的DNA,结果均为阴性,表明该菌株基因组中无鼠疫菌标识基因序列。针对55023菌株进行的MLST分析结果表明,该株菌样品中6个看家基因片段(2 509 bp)与已知的鼠疫菌存在16个碱基差异,而鼠疫菌中这些片段应该是完全一致的[1],更进一步表明55023不是鼠疫菌;55023的MLST序列与假结核菌血清Ⅲ型32937菌株只有两个碱基的差异,提示该菌可能是血清 III型的假结核菌。对55023菌株进行全基因组序列测定将会给出更为确切的结论。

以表型鉴定为基础的原鼠疫诊断国家标准(GB15991-1995)在我国鼠疫防治工作中发挥了重要作用,但是在某些方面已经不适应当前的需要;如果单纯基于表型进行鼠疫菌的鉴定,可能会导致误报和漏报。2008年新颁布的鼠疫诊断标准(WS 279-2008)已经确定了核酸检测在鼠疫菌鉴定中的重要作用;但由于新标准颁布时间不长,还需要有关部门加大宣贯工作的力度;同时提升基层鼠疫防治机构的硬件水平,积极推广分子生物学检测手段,进而提高鼠疫菌检测鉴定的准确性和可靠性。

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