羊种布氏菌体外药物敏感性分析＊

姜 海,崔步云,赵鸿雁,朴东日,李兰玉

布氏菌病(布病)是由布氏菌属的细菌侵入机体后引起传染-变态反应性人兽共患传染病。布病是一个世界范围内的重要的公共卫生事件,给流行地区和国家造成巨大的经济损失并严重危害人类健康[1]。近年从全国十余个省市区分离的近百株布氏菌鉴定结果显示,既往认为强毒的羊种菌仍然是当前的主要流行菌型,个别是牛种菌,野毒猪种菌多年未分离到;因而,羊种菌是引起疾病暴发的主要传染源[2]。早期布病治疗可以防止由急性转为慢性,减少复发,消灭后遗症。因此,早期合理用药是治愈布病患者的关键。目前急性期布病的治疗,多采用联合抗菌疗法,多西环素和链霉素或多西环素和利福平仍然是一线首选药物。随着医药学的不断发展,一些新型抗生素被应用于布病的治疗,如喹诺酮类、头孢菌素类和大环内酯类等抗生素。近年来,国外已有布氏菌耐药株的报道[3]。为了解我国羊种菌的耐药谱并为临床治疗提供指导,本研究对全国不同地区2005-2009年分离到的69株羊种菌进行耐药分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 69株分离自病人的地方株分别来自内蒙古自治区(10)、山西(9)、河北(10)、山东(4)、辽宁(18)、陕西(4)、长沙(1)、广东(10)、云南(1)和浙江(2),由中国疾病预防控制中心传染病所布病室保存。药敏质控菌株为肺炎链球菌ATCC49169。

1.2 方法

1.2.1 细菌复苏与鉴定从菌株库取出标准和地方分离冻干菌株,复苏、转种于布氏菌专用培养基,生长48h后转种1次,细菌鉴定应用布氏菌特异噬菌体、单项血清凝集和染料抑菌试验。

1.2.2 药敏实验 药敏板包括12种抗生素:阿奇霉素、克拉霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、多西环素、利福平、头孢曲松、复方新诺明、链霉素,由天津金章公司提供。药敏试验使用微量稀释MIC法,判读结果按美国实验室标化委员会制定标准进行(CLSI2009,M100-S19)。

1.2.323S rRN A扩增与测序 1 013bp的部分23S rRN A基因(转肽酶中心区)被扩增,引物序列为 (上游:5’-GGTGCTGGAAGGTTAAGA-3’,下游:5’-CGGTAAGCTGCA TGCGT-3’)。扩 增 参数:95℃5m;95℃30s,56℃30s,72℃50s;40个循环。PCR产物送至北京擎科生物公司纯化测序。

2 结 果

2.1 药敏结果 根据美国实验室标化委员会制定标准,除了阿奇霉素和克拉霉素外,所有69株菌均对其它10种抗生素敏感。具体结果见表1。

2.2 23S rRN A序列所有菌株序列与B.abortus23S rrnA gene(GenBank:AE017223)比对 ,发现所有菌株都具有单核苷酸多态性2632 T/C。2632 T仅存在于大环内酯类敏感株B.suis中,部分菌株序列比对结果见图1。

表1 羊种布鲁氏菌体外药物敏感试验结果Table 1 Antimicrobial susceptibility ofB.melitensis

图1 部分菌株23SrRNA转肽酶中心序列比对结果Fig.1 Alighment of 23SrRNApeptidy transferase center nucleotides sequences of partialB.melitensisstrains

3 讨 论

布氏菌为胞内寄生菌,在疾病的早期,细胞免疫及体液免疫联合作用将入侵的布氏菌进行消灭而痊愈;若不能将其彻底杀灭清除,则布氏菌及其代谢产物和内毒素等反复刺激机体致敏 T淋巴细胞,当再次接触布氏菌相关抗原时,致敏淋巴细胞就会释放出各种淋巴因子,从而导致以单核细胞浸润为特征的变态反应性炎症,形成肉芽肿、纤维组织增生等慢性病变。所用的药物只有进入细胞才能发挥作用,所以用于治疗布病的抗菌药物,既要在体外有杀菌作用,又要能渗入到细胞内,而且要达到足够的浓度。多西环素、利福平和链霉素属于这类药物,因而一直作为患者的一线用药。但由于这些抗生素对部分人毒副作用大,不能保证足够的剂量和疗程,因而很容易转为慢性病人,从而导致布病治疗的难度进一步加大,对国家布病防治规划的有效实施构成严重威胁。2006年,希腊约阿尼纳建议书指出:传统的一线用药仍是布病治疗的金标准;复方新诺明和喹诺酮类可以作为二线替代药物[6]。在一些发展中国家,布病和结核通常在某一社区共存,利福平耐药株的出现已成为当地重大公共卫生问题之一。本研究结果发现辽宁省有12株菌达到较高利福平MIC值(2μg/mL),推测属于中介值。利福平耐药基因rpoB突变位点 PCR检测可以验证是否为真正耐药,所有69株菌rpoB基因序列未发现任何突变(资料待发表)。但笔者认为应开展布病利福平耐药监测工作。

大环内酯类抗生素结合于核糖体50S亚基的转肽酶中心与肽输出通道狭窄之间的部分,通过机械性的阻塞通道而抑制肽的延伸,从而阻碍蛋白质的合成而发挥抑菌作用。大环内酯类抗生素的结合位点位于核糖体50S亚单位的23S rRN A。Halling等人报道耐大环内酯类药物突变位点在23S rRN AV区中心环的2632位,提示引起耐药的主要机制是核糖体50S亚单位的23S rRN AV区中心环的点突变[7]。本研究发现所有菌株都对大环内酯类药物呈现高水平耐药,且突变位点也在23S rRN AV区中心环的2632T/C,而其他位点未发现突变,与文献报道吻合。除此,Halling还指出药物外排使菌体内药物浓度降低而产生耐药;中国菌株是否存在药物外排机制还需进一步验证。

尽管布氏菌的耐药性不是布病防控领域内的关键问题,但合理选择抗生素可以减轻布病疾病负担,以利病人早日康复,为布病控制筑起第一道防线。

[1]Matyas Z,Fujikura T.Brucellosis as a world problem[J].Dev Biol Stand,1984,56(5):3-20.

[2]崔步云.中国布鲁氏菌病疫情监测与控制[J].疾病监测,2007,22(10):649-651.

[3]Marianelli C,Ciuchini F,Tarantino M,et al.Genetic bases of the rifampin resistance phenotype inBrucellaspp[J].J Clin Microbiol,2004,42(12):5439.

[4]Brown SD,Traczewski MM.Broth microdilution susceptibility testing ofBrucellaspecies:quality control limits for ten antimicrobial agents against three standard quality control strains[J].J Clin Microbiol,2005,43(11):5804 5807.

[5]Turkmani A,Ioannidis A,Christidou A,et al.In vitrosusceptibilities ofBrucella melitensisisolates to eleven antibiotics[J].Ann Clin Microbiol Antimicrob,2006,5(1):24-27.

[6]Ariza J,Bosilkovski M,Cascio A,et al.Perspectives for the Treatment of Brucellosis in the 21st century:the ioannina recommendations the policy forum allows health policy makers around the world to discuss challenges and opportunities for improving health care in their societies[J].PLoS Medicine,2007,4(12):1872-1877.

[7]Halling SM,JensenAE.Intrinsic and selected resistance to antibiotics binding the ribosome:analyses ofBrucella23S rrn,L4,L22,EF-Tu1,EF-Tu2,efflux and phylogenetic implications[J].Microbiol,2006,6:84-99.