HPLC法同时测定黄海棠中山柰酚和槲皮素的含量Δ

张伟，于海林，宋艳丽，康文艺#

（1.黄河科技学院，郑州市 450063；2河南大学中药研究所，开封市 475004）

HPLC法同时测定黄海棠中山柰酚和槲皮素的含量Δ

张伟1，2＊，于海林2，宋艳丽2，康文艺2#

（1.黄河科技学院，郑州市 450063；2河南大学中药研究所，开封市 475004）

目的：建立同时测定黄海棠中山柰酚和槲皮素含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Purospher Star RP-C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-0.025mol·L-1磷酸水溶液（60∶40），流速为1.0mL·min-1，柱温为25℃，检测波长为370nm。结果：山柰酚、槲皮素进样量的线性范围分别为0.0184～0.1288μg（r＝0.9998）、0.008～0.064μg（r＝0.9999）；二者的平均加样回收率分别为97.12%（RSD＝1.03%，n＝6）、96.51%（RSD＝1.32%，n＝6）。结论：本方法灵敏、准确、重复性好，可用于黄海棠的质量控制。

黄海棠；高效液相色谱法；山柰酚；槲皮素；含量测定

藤黄科金丝桃属植物黄海棠（Hypericum ascyronL.）又名红旱莲、湖南连翘等，为多年生草本植物，分布于我国东北地区及黄河、长江和珠江流域。民间将其广泛用于止痛、抗菌消炎、治疗创伤等[1]。黄海棠的化学成分和药理研究不是很多，已有的研究证明其有良好的抗炎镇痛效果[2]；从中分离得到了黄酮、口山酮和间苯三酚衍生物等化合物[3～7]。山柰酚（kaempferol）和槲皮素（quercetin）为黄海棠中黄酮类主要成分，具有降压、降血脂及抗肿瘤等作用[8～11]。有研究用分光光度法对黄海棠总黄酮含量进行了测定[12]，该方法操作复杂且只能测定总黄酮含量。笔者在对该植物系统化学和药理作用的研究中，首次采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定了黄海棠中山柰酚和槲皮素的含量，可为评价该药材质量及合理用药提供依据。

1 仪器与试药

LC-2010A型HPLC仪，包括CLAS-VP色谱工作站、UV-2010A检测器、自动进样器、柱温箱、四元低压梯度泵（日本岛津公司）；KQ-500DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

甲醇为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯；山柰酚、槲皮素标准品（河南大学中药研究所自制，质量分数：98%）；黄海棠全草于2006年6月采集于河南省栾川县，由河南大学中药研究所生药教研室李昌勤副教授鉴定为藤黄科植物黄海棠H.ascyronL.，标本存放于河南大学中药研究所（No.06070103）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Purospher Star RP-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.025mol·L-1磷酸水溶液（60∶40）；流速：1.0mL·min-1；柱温：25℃；检测波长：370nm；进样量：10μL。在此条件下，槲皮素、山柰酚与其他成分的分离度R＞1.5，保留时间适中，理论板数按山柰酚峰计算应不低于3000。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.山柰酚标准品；B.槲皮素标准品；C.黄海棠；1.山柰酚；2.槲皮素Fig1 HPLC chromatogramsA.kaempferide control；B.quercetin control；C.H.ascyron；1.kaempfeide；2.quercetin

2.2 混合标准品溶液的制备

精密称取山柰酚标准品2.3mg和槲皮素标准品1.0mg，加甲醇制成每1mL含山柰酚0.0092mg和槲皮素0.0040mg的混合标准品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

将干燥的黄海棠全草粉碎，过60目筛，精密称取粉末40.0mg，置10mL容量瓶中，精密加入50%甲醇水溶液8mL，静置12h，超声（功率：500W，频率：80kHz）提取 20min，放冷，定容至10mL，摇匀，以微孔滤膜（0.45μm）过滤，即得。

2.4 线性关系考察

精密吸取槲皮素和山柰酚混合标准品溶液适量，注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得山柰酚的回归方程为Y＝3×106X－1498.2（r＝0.9998），进样量的线性范围为0.0184～0.1288μg；槲皮素的回归方程为Y＝4×106X－199.3（r＝0.9999），进样量的线性范围为0.008～0.064μg。

2.5 精密度试验

取山柰酚和槲皮素混合标准品溶液，连续进样5次，每次10μL，测定峰面积。结果，山柰酚和槲皮素峰面积的RSD分别为0.38%和1.19%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取室温放置的同一批号的黄海棠供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8、10、12h进样10μL，测定峰面积。结果，山柰酚和槲皮素峰面积的RSD分别为1.68%和1.03%（n＝7），表明供试品溶液在12h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一批号样品6份，每份40mg，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，各进样10μL，测定峰面积。结果，山柰酚和槲皮素峰面积的RSD分别为1.29%和1.44%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

称取已知山柰酚和槲皮素质量分数的黄海棠粉末20mg，置于10mL容量瓶中，平行6份，分别加入等量山柰酚和槲皮素标准品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定质量分数，计算加样回收率，结果分别见表1、表2。

表1 山柰酚的加样回收率试验结果（n＝6）Tab1 Results of recovery test of kaempferol（n＝6）

表2 槲皮素的加样回收率试验结果（n＝6）Tab2 Results of recovery rate of quercetin（n＝6）

2.9 样品含量测定

取不同批次样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述方法测定黄海棠中山柰酚和槲皮素的含量，结果见表3。

表3 黄海棠中槲皮素与山柰酚的含量测定结果（g·g-1，n＝3）Tab3 Content determination of quercetin and kaempferide in H.ascyron（g·g-1，n＝3）

3 讨论

3.1 流动相条件的选择

在选择分离条件时，曾选用甲醇-0.025mol·L-1磷酸水溶液和乙腈-0.025mol·L-1磷酸水溶液等[13，14]不同系统进行洗脱，结果表明，甲醇与磷酸水的体积比为60∶40、流速为1.0mL·min-1时分离效果最佳，山柰酚和槲皮素与其相邻峰的分离度＞1.5，符合定量分析要求，且保留时间较短，分析较快。

3.2 提取条件的选择

山柰酚和槲皮素溶于含水的醇，在此基础上考察了体积分数分别为25%、50%、75%、100%的甲醇水溶液的提取效果，结果发现体积分数为50%的甲醇水溶液提取率最高。在50%甲醇水溶液提取的基础上，又考察了提取时间10、20、30、40min，结果显示在20min时已经提取完全，因此采用体积分数为50%的甲醇水溶液，提取20min。

本试验首次建立了同时测定黄海棠中山柰酚和槲皮素含量的方法。该方法灵敏、准确、重复性好，可用于黄海棠药材的质量控制。

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Content Determination of Kaempferol and Quercetin inHypericum ascyronby HPLC

ZHANG Wei
（Huanghe College of Science and Technology，Zhengzhou 450063，China）
ZHANG Wei，YU Hai-lin，SONG Yan-li，KANG Wen-yi
（Institute of Chinese Materia Medica，Henan University，Kaifeng 475004，China）

OBJECITVE：To establish the method for the content determination of kaempferol and quercetin inHypericum ascyron.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on Purospher Star RP-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-0.025mol·L-1phosphate（60∶40）at flow rate of 1.0mL·min-1.The column temperature was 25℃ and determination wavelength was set at 370nm.RESULTS：The linear ranges of kaempferol and quercetin was 0.0184～0.1288μg（r＝0.9998）and 0.008～0.064μg（r＝0.9999）.The average recoveries were 97.12%（RSD＝1.03%，n＝6）and 96.51%（RSD＝1.32%，n＝6）.CONCLUSION：The method is sensitive，accurate，and reproducible for the simultaneous determination of kaempferol and quercetin inH.ascyron.

Hypericum ascyron；HPLC；Kaempferol；Quercetin；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2011）19-1790-03

Δ河南省科技厅重点攻关项目（102102310019）

＊讲师，硕士研究生。研究方向：中药活性成分。电话：0371-66607902。E-mail：zzzwwwqq@126.com

#通讯作者：教授。研究方向：中药活性成分及新药研发。电话：0378-3880680。E-mail：kangweny@hotmail.com

2011-02-28

2011-03-29）