紫花地丁HPLC指纹图谱研究

朱 婕，洪俊丽，秦民坚

(中国药科大学中药资源学教研室，教育部现代中药研究重点实验室，江苏南京211198)

紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁(Viola yedoensis Makino)的干燥全草，性寒，味苦、辛，具有清热解毒，凉血消肿之功效。用于疔疮肿毒，痈疽发背，丹毒，毒蛇咬伤［1］。在我国除了青海、西藏外分布广泛。现代药理学研究证明，紫花地丁具有抗菌，抗炎，抗病毒，抗氧化等药理活性［2－4］，并具有免疫增强功能和降脂作用［5－6］。

自古以来紫花地丁来源混乱，各地习用药材种类繁多，紫花地丁同名异物现象严重，而且市面上紫花地丁药材质量差异较大。紫花地丁药材及其混淆品的HPLC指纹图谱研究已有报道［7］，并已有高效液相色谱法测定紫花地丁中某一成分的研究报道。但目前的指纹图谱分析未对主要成分峰进行归属，且仅测定药材中单一成分的含量，无法全面反应药材的内在质量。为了确保紫花地丁用药安全，减少品种乱用现象，控制药材质量，本实验利用HPLC法建立了12批紫花地丁商品药材的指纹图谱，指认了4个特征峰并建立其含量同时测定方法，比较它们在药材中的含量，反映药材内在质量差异。以期为紫花地丁整体化学成分进行质量控制提供有效方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Aglient 1100高效液相色谱仪(四元泵、柱温箱、自动脱气机，单波长紫外检测器、Aglient 1100色谱工作站);中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版;MP120－1型电子分析天平(上海第二天平仪器厂)。

1.2 试剂

色谱甲醇(江苏淮阴汉邦科技有限公司)，实验用水为乐百氏纯净水(广州百氏食品饮料有限公司)，其余所用试剂皆为分析纯。

1.3 样品及对照品

紫花地丁分别购于江苏、河北、湖北、安徽、河南等地药材市场或药店，由中国药科大学秦民坚教授鉴定为堇菜科植物紫花地丁(Viola yedoensis Makino)的干燥全草。药材粉碎，过60目筛，备用。菊苣苷、七叶内酯、早开堇菜苷均为本实验室自制，经1H－NMR、12C－NMR和MS鉴定，并经HPLC检测，纯度均高于98%，东莨菪素(批号:110768－200504)购自中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Aglient C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)。流动相:0.5%醋酸水溶液(A)－甲醇(B)。洗脱梯度:0～5 min，5% ～19%B，5 ～40 min，19% ～21%B，40～58 min，21% ～30%B，58 ～75 min，30% ～70%B，75 ～100 min，70% ～95%B。柱温:30°C，流速:1.0 mL/min，检测波长:353 nm，进样量20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别称取菊苣苷、七叶内酯、东莨菪素、早开堇菜苷适量，加甲醇分别配制成浓度分别为0.028 8 mg/mL，0.045 mg/mL，0.009 5 mg/mL，0.005 4 mg/mL的对照品溶液，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取紫花地丁药材干燥细粉1.0 g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇15 mL，热回流提取1 h，放冷至室温，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

分别称取菊苣苷、七叶内酯、东莨菪素、早开堇菜苷对照品适量，加甲醇配置成一系列对照品溶液，按色谱条件分别进行HPLC检测，以溶液浓度X(mg/mL)为横坐标，积分峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，菊苣苷、七叶内酯、东莨菪素、早开堇菜苷质量浓度分别在0.012～1.17 mg/mL，0.002 0 ～ 0.039 mg/mL，0.001 0 ～ 0.20 mg/mL，0.004 9～0.034 mg/mL范围内呈良好的线性关系。结果见表1。

表1 菊苣苷、七叶内酯、东莨菪素和早开堇菜苷的线性关系

2.4.2 菊苣苷、七叶内酯、东莨菪素、早开堇菜苷的含量测定

根据“2.1”项下方法对12个批次的供试品进行测定，根据标准曲线计算出各样品在供试品中的含量，结果见表2。

表2 菊苣苷、七叶内酯、东莨菪素和早开堇菜苷的含量/%

2.4.3 精密度实验

称取紫花地丁药材(S1)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样5次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积 RSD分别为1.56% ～2.47%和1.33% ～2.51%，符合指纹图谱色谱条件技术要求。

2.4.4 稳定性实验

称取紫花地丁粉末(S1)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在 0，4，8，12，16，20 和24h 分别进行检测，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积 RSD 分别为 1.84% ～2.49% 和 2.78% ～2.84%，表明供试品溶液在24 h内稳定，符合指纹图谱色谱条件技术要求。

2.4.5 重复性实验

称取紫花地丁粉末(S1)6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积 RSD分别为1.89% ～2.74%和1.69%～2.11%，表明方法重复性良好，符合指纹图谱色谱条件技术要求。

2.4.6 加样回收率实验

称取已知含量的紫花地丁粉末6份(S1)，加入1 mL对照品溶液，按选定的色谱条件进行测定。结测得菊苣苷、秦皮乙素、东莨菪素、早开堇菜的加样回收率分别为 96.01% ～101.77%，95.37% ～104.59%，95.53% ～ 104.42% 和 97.48% ～104.65%，RSD 值分别为 1.14%、1.60%、2.23%和 2.61%。

2.5指纹图谱的分析与评价

2.5.1 指纹图谱的建立及共有峰的的标定

取紫花地丁药材，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，将对照品和12个供试品溶液按选定的色谱条件分别进样，进行测定分析，得到样品HPLC色谱图。以批号8参照图谱，生成对照图谱，见图1。

图1 12批紫花地丁样品对照图谱

经对照品定性，鉴定出1号色谱峰为菊苣苷，6号色谱峰为七叶内酯，9号色谱峰为东莨菪素，13号色谱峰为早开堇菜苷，见图2。

图2 菊苣苷、七叶内酯、东莨菪素和早开堇菜苷对照图谱

利用中国药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004版A)处理图谱，确定18个共有峰。其中七叶内酯峰(19.37 min)峰面积最大，与相邻峰分离度较好，因此选定七叶内酯为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见图3。

图3 12批紫花地丁药材对照指纹图谱共模式

2.5.2 相似度评价

将12批紫花地丁药材采用用中国药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004版A)，使用中位数法对所得的HPLC指纹图谱全谱进行相似度计算，并对共有峰的相对峰面积进行计算，结果见表2。

表2 紫花地丁药材相似度结果

3 讨论

由于药材可能受到采收期、土壤、气候等环境因素及采收加工、运输等诸多因素的影响，使内部的化学成分有所差异，从而影响药材质量。本文对12个批次的紫花地丁商品药材进行了HPLC分析，选择了稳定性好，吸收强的18个色谱峰作为共有峰。结果显示这12批的紫花地丁药材相似度大于0.931，共有峰占总出峰数的比例大于90.98%。证明这12批药材无显著性差异，所选择的共有峰可以作为紫花地丁药材指纹图谱的特征峰，可以作为鉴别紫花地丁药材真伪的依据。

单一的活性成分或指标成分难以有效地评价中药的真伪优劣。因此本次试验经过与对照品比对，以菊苣苷、七叶内酯、东莨菪素、早开堇菜苷作为指标性成分，比较了上述成分在商品药材中的含量差异。定量的结果表明，菊苣苷、秦皮乙素、东莨菪素、早开堇菜苷含量分别为 0.016% ～3.006 mg/g，14.438% ～14.912 mg/g，0.183% ～0.524 mg/g 和0.221% ～0.513 mg/g。因此可以考虑将这4种成分的含量作为判定药材质量的标准。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］:北京:人民卫生出版社，2005:317.

［2］Ewa W B，Wiesawa B，Irena M，et al.Antimicrobial activity of Viola tricolor herb［J］.Fitoterapia，2005，76(5):458－461.

［3］李海涛，赵 红，顾定伟，等.紫花地丁水煎剂调节小鼠免疫细胞分泌L－2、TNF－α的体外研究［J］.山东中医杂志，2004，23(10):617－619.

［4］Ma S C，Du J，Paulpuihay B.Antiviral Chinese medical herbs against respiratory syncytial virus［J］.J Ethnopharmacology，2002，79(2):205－211.

［5］李培锋，贺春阳，关 红.五种中药的免疫作用研究［J］.内蒙古农牧学院学报，1990，11(2):90－93.

［6］黄 海，胡 昕，郭海威，等.一种脂肪酶激活剂的性质的初步研究［J］.上海大学学报:自然科学版 ，1999，5(3):249－251.

［7］陈胡兰，汤沛然，张 梅，等.紫花地丁药材及其混淆品的HPLC指纹图谱研究［J］.中国药学杂志，2010，45(18):1372－1375.