NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸对顺铂肾毒性的影响

孙筱茹，张雅楠，陈一辰，齐 飞，罗 政，李茹男，郭连英，郝 冰，施广霞

(1.大连医科大学 2007级临床医学专业，辽宁 大连 116044；2.大连医科大学 病理生理教研室，辽宁 大连 116044)

核因子κB(nuclear factorκB， NF-κB)，是1986年Sen和Baltimore首先发现并对其进行了描述，因其能与B细胞免疫球蛋白上的轻链基因增强子κB序列(GGGACT1TCC)特异结合而得名[1]。NF-κB近年来越来越受到人们的关注，它不仅通过调控细胞因子等的表达参与各种免疫、炎症、应激性反应，还是细胞内重要的抗凋亡、促增殖的信号，NF-κB的组成性表达和异常活化是肿瘤化疗耐药的重要机制[2]， NF-κB抑制剂的抗肿瘤作用近年来已开始受到人们的重视并开发出多种小分子制剂[3]，吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是研究应用较多的一种。顺铂是常用的抗肿瘤药物，用于治疗肺癌、肝癌和卵巢癌等多种常见恶性肿瘤，但顺铂的全身毒性是不可忽视的，尤其是肾毒性和对造血功能的影响，临床顺铂化疗肾损害发生率为25%～35%[4]。本实验使用NF-κB抑制剂PDTC与顺铂合用，观察其对顺铂毒性作用的影响，以探讨NF-κB在顺铂所致毒性中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SD大鼠60只(体重210～250 g)，由大连医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂和仪器：PDTC(25 mg/kg)、顺铂(10 mg /2 mL)(由山东多欣药业有限公司提供)、0.9%生理盐水、一氧化氮试剂盒、碘[125I]白细胞介素1放射免疫分析药盒、碘[125I]肿瘤坏死因子-α放射免疫分析药盒(均由北京普尔伟业生物科技有限公司提供)考马斯亮蓝、乙醇、96孔板、721分光光度计、匀浆器、离心机、水浴槽。

1.2 方 法

1.2.1 实验分组及用药：先取20只SD大鼠分别腹腔注射顺铂和顺铂+PDTC，观察动物至死亡，以确定用药剂量和动物模型终止时间。再取40只SD大鼠随机分为4组，分别是空白对照组，PDTC组，顺铂组，PDTC及顺铂联合用药组，每组10只。腹腔注射，空白对照组(生理盐水0.2 mL/d)，PDTC组(PDTC 25 mg/kg、0.1 mL/d，生理盐水0.1 mL/d)，顺铂组(顺铂10 mg /2 mL 、0.1 mL/d，生理盐水0.1 mL/d)，PDTC及顺铂联合用药组(PDTC 25 mg/kg、0.1 mL/d，顺铂10 mg /2 mL,0.1 mL/d)。

1.2.2 标本及指标的采集：对照组和PDTC组于实验第13天、顺铂组和顺铂+PDTC组于用药后第4天经大鼠尾取血，做白细胞计数。次日处死所有大鼠，大鼠内眦取血做血涂片、白细胞计数和分离血清，称体重和肾重。取肾组织加入生理盐水制备肾组织匀浆。

1.2.3 采用放射免疫分析测血清和肾组织匀浆中细胞因子TNF-α和IL-1的量，用生物化学方法测血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)含量。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 肾系数(肾/体)各组间比较

实验结果表明顺铂对大鼠有较大毒性，预实验中10只大鼠于9 d内全部死亡，合用PDTC未延长大鼠的寿命，必须缩短观察时间实验才能进行。4组中应用顺铂的大鼠肾系数增高，为4.9440±0.5456，与对照组比较差异具有显著性意义，P<0.05，PDTC组与对照组、PDTC联合顺铂组与单用顺铂组比较肾系数的差异无显著性意义，P>0.05。见表1。

表1 用药后肾系数的变化

1)与对照组比较，P<0.05；2)与PDTC组比较，P<0.05

2.2 各组间外周血白细胞计数比较

注射顺铂的小鼠外周血白细胞数目降低至(3780±1760.713)个/mm3，与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05)，合用PDTC组外周血白细胞数略有增加，但与顺铂组比较差异无显著性意义(P>0.05),见表2。

表2 用药后外周血白细胞计数变化

1)与对照组比较，P<0.05；2)与PDTC组比较，P<0.05

2.3 大鼠血清和肾组织匀浆TNF-α、IL-1含量的变化

注射顺铂大鼠TNF-α顺铂组血清中TNF-α的含量低于对照组,应用顺铂后大鼠血清IL-1水平没有明显变化，肾组织匀浆IL-1含量明显增加。联合应用PDTC 后含量下降，与单用顺铂组比较差异具有显著性意义(P<0.05)。

表3 用药后大鼠血清和肾组织匀浆TNF-α、IL-1含量的变化

1) 与对照组比较，P<0.05；2)与PDTC组比较，P<0.05；3)与顺铂组比较，P<0.05

2.4 大鼠血清BUN、Cr含量

单用顺铂或合用PDTC的大鼠血清BUN及Cr较对照组均有明显升高(P<0.05)，而两组之间的差异无显著性意义。见表4。

表4 大鼠血清BUN和Cr含量的变化

1)与对照组比较,P<0.05

3 讨 论

PDTC有清除氧自由基的作用，Rangan等[5]最早应用于体内抑制大鼠肾小管内皮细胞NF-κB的激活，剂量达200 mg/kg，未发现明确的毒性作用。选择抗氧化剂PDTC来抑制NF-κB的激活是依据：(1)许多已知的IκBα磷酸化诱导物可使活性氧产生增加。NF-κB抑制蛋白-IκBα的降解又是NF-κB活化的中心环节。(2) H2O2：可激活某些细胞中的NF-κB,活性氧是顺铂引起肾毒性的重要机制[6]。(3)TNF-α诱导的信号传导可以产生活性氧介质(ROS)。PDTC对甘油所致肾损伤有保护作用[7]。本实验结果表明顺铂对大鼠有很强的毒性，出现体重降低、肾脏肿大和血清BUN与Cr含量增高、外周血白细胞数目减少等。PDTC 本身不引起上述毒性反应，但本实验条件下合用PDTC不能减轻上述毒性反应。

顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡与死亡受体及配体有关,顺铂处理的大鼠肾小管上皮细胞Fas、Fas-L、TNF-α mRNA表达显著增高[8]。现已有人观察到顺铂肾损害过程中大量的炎性细胞因子、趋化因子的活化,并认为TNF-α可能是中心启动环节。PDTC抑制NF-κB传导通路的活化，即抑制了TNF-α基因位点的转录活性，减少致炎因子的基因表达与合成释放,减少TNF-α的表达[7]。应用PDTC的正常大鼠肾组织匀浆中TNF-α含量降低。但与顺铂联合用药后不能降低肾组织匀浆TNF-α含量，顺铂处理的大鼠肾组织匀浆IL-1含量明显升高，联合PDTC可降低其含量。本实验的结果说明PDTC本身无明显毒性，能降低顺铂处理的大鼠肾组织匀浆中IL-1的含量，这些变化在顺铂肾毒性产生的机制与防治中的意义还有待进一步研究。

[1] Sen R,Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequence[J].Cell,1986,46 (5):705-716.

[2] Saxaki N,Morisaki T,Hashizume K.Nuclear factor-κB p65 (RelA) transcription factor is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue[J].Clin Cancer Res,2001,7(12):4136-4142.

[3] Gupta S,Sundaram C,Reuter S.Inhibiting NF-κB activation by small molecules as a therapeutic strategy[J].BBA-Gene Regul Mech,2010,1799: 775-787.

[4] Ramesh G,Reeves WB.Salicylate reduces cisplatin nephrotoxicity by inhibition of tumor necrosis factor-α[J].Kidney Int,2004,65(2): 490-498.

[5] Rangan GK,Wang Y,Tay YC,et al．Inhibition of nuclear factor-κB activation reduces cortical tubulointerstitial injury in protein uric rats[J]．Kidney Int，1999,56(1)：118-134.

[6] Rasoulian B,Jafari M,Mahbod M,et al.Pretreatment with oxygen protects rat kidney from cisplatin nephrotoxicity[J].Ren Fail,2010,32(2):234-242.

[7] Tamada S,Asai T,Kuwabara N,et al.Inhibition of nuclear factor- κB activation reduces glycerol-induced renal injury[J].J Nephrol,2006,19(4):439-448.

[8] Tsuruya K,Tokumoto M,Ninomiya T,et al.Direct involvement of the receptor-mediated apoptotic pathways in cisplatin-induced renal tubular cell death[J].Kidney Int,2003,63 (1):72-82.