中性粒细胞在实验性小鼠肾毒性损伤中的变化及其意义

李传刚，高华琨，孙章萍，罗世华，杨 明，郝伟莹，戚 婷，胡 云，李媛媛，舒晓宏，李墨林

(1.大连医科大学 附属第二医院 泌尿外科,辽宁 大连 116027； 2.大连医科大学 临床医学08级学生，辽宁 大连 116044；3.大连医科大学 药物化学教研室，辽宁 大连 116044； 4.大连医科大学 病理生理学教研室，辽宁 大连 116044)

顺铂(cisplatin，DDP)是临床常用的治疗实体肿瘤最有效的药物之一,但DDP剂量依赖性的肾毒性作用极大限制了其疗效的发挥。研究表明，DDP肾毒性的主要靶位是肾小管上皮，特别是近曲小管直部上皮细胞[1]，引起损伤局部缺血、缺氧、甚至灶状坏死。DDP肾毒性损伤的发生机制尚未完全阐明,目前认为可能与氧化应激损伤有关[2,3]。由于吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)具有与金属螯合的特性，可清除脂质过氧化代谢中间产物以及抑制组织细胞中核转录因子NF-κB的激活及核移位，从而发挥抗炎性和抗氧化效应[4]。因此，本课题前期研究将PDTC用于DDP肾毒性损伤的防治。结果发现，50 mg/kg PDTC能有效预防大剂量DDP所致的肾毒性损伤[5]，提示大剂量DDP所致的肾损伤可能不但与氧化应激损伤有关，也可能与炎症有关。同时，Faubel S[6]研究发现DDP所致肾毒性损伤的肾组织中IL-1β、IL-18和IL-6含量增高，并有中性粒细胞浸润，但中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)在DDP所致肾损伤中作用至今尚不清楚。本研究在既往研究的基础上，进一步探索PMN激活在大剂量DDP肾毒性损伤中的作用，为深入研究DDP肾毒性损伤的机制及其防治奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要药品与试剂

注射用顺铂系江苏豪森药业股份有限公司产品(30 mg/6 mL),产品批号:091101。髓过氧化物酶(MPO)试剂盒系南京建成生物制品研究所产品。

1.2 动物与处理

昆明种小鼠40只，雌雄各半，体质量为28～33 g，平均(31.71±1.82)g，由大连医科大学实验动物中心提供。饲养于室温16～28℃，相对湿度40%～70%环境中，自由饮水和进食。经适应性喂养后，依体重随机分为4组：DDP用药6 、24、48 h组和生理盐水(NS)对照组，每组10只小鼠，性别和周龄相匹配。DDP针剂用生理盐水配成1 mg/mL溶液，DDP用药组小鼠腹腔注射DDP 0.12 mL/10 g体重，对照组小鼠腹腔内注射等量NS。分别取对照组和DDP用药后6、24、48 h组的小鼠，称重后乙醚麻醉，内眦静脉取血、肝素抗凝，全自动血细胞仪进行白细胞(WBC)计数及分类，生化法检测血尿素氮和肌酐含量。随后，剖腹取小鼠两侧肾脏，制备10%肾皮质匀浆，比色法测定血浆和肾组织匀浆中MPO的含量。

1.3 标本的制备

1.3.1 血浆的制备：小鼠乙醚麻醉后，内眦静脉取血、肝素抗凝，全血，静置后离心3000 r/min,10 min，血浆置4℃冰箱备用。

1.3.2 肾皮质组织匀浆的制备：剖腹后迅速取出两侧肾脏，切下肾皮质部分，每0.1 g 肾皮质组织加入0.9 mL NS置玻璃匀浆器中反复研磨,制成10%的肾皮质匀浆，离心3000 r/min，10 min，上清置4℃冰箱内备用。

1.4 检测指标

1.4.1 外周血WBC和PMN计数：分别取对照组和DDP用药后6、24、48 h的小鼠，乙醚吸入麻醉后内眦静脉取血、肝素抗凝，取少量抗凝血与等量肝素混合后全自动血细胞仪进行WBC胞计数和分类的检测，了解DDP用药前、后小鼠外周血WBC和PMN计数的变化。

血浆尿素氮(BUN)含量的测定:采用二乙酰一肟显色法。分别将血浆、水或BUN标准应用液(含0.005 mg氮/mL)与二乙酰-肟-氨硫脲(DAM- TSC液)及二酸(浓磷酸和浓硫酸)混合液混合后，置沸水中煮沸10 min，流水冷却3 min，520 nm 波长比色，以空白管调零,测各管的光密度值(A值)。利用下公式计算待测管血浆BUN含量(mmol/L)。

0.357×0.002×100/0.02

1.4.3 血浆肌酐(CRE)含量的测定:采用苦味酸沉淀蛋白法。 分别将血浆、水或肌酐标准应用液(0.05 mg/dL)与碱性苦味酸混匀后，置37°C水浴30 min，510 nm波长比色，以空白管调零，读各管的A值，然后各管再加50%乙酸溶液两滴，放置6 min后，再测各管的A值(A值’)。利用下公式计算待测管血肌酐含量(μmol/L)。

88.4×0.01/0.2×100

1.4.4 肾皮质匀浆组织蛋白含量:采用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量,蛋白标准液采用牛血清白蛋白(1 mg/mL)。取1 mg/mL的标准蛋白质溶液倍比稀释，比色法测A595 值并绘制蛋白标准曲线；然后取10%肾皮质匀浆样品，比色法测A595 值，从标准曲线上查出其相应的蛋白质含量。

1.4.5 血浆和肾组织MPO含量的检测：比色法检测，采用南京建成生物工程研究所生产的MPO试剂盒，按说明书要求进行测定。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 DDP用药后外周血WBC数量及分类的变化

DDP用药后小鼠外周血WBC计数进行性下降，DDP用药后48 h，小鼠外周血WBC计数下降至(3.7±0.66)×109/L，与对照组小鼠(5.93±0.55)×109/L比较，差异具有显著性意义(P<0.01)。DDP用药后24 h内，DDP用药组小鼠外周血涂片可见中性粒细胞脱颗粒现象，无法进行WBC分类；DDP用药后48 h，外周血涂片未见明显的中性粒细胞脱颗粒现象，此时，DDP用药组小鼠PMN计数为(1.47±0.99) ×109/L，与对照组(1.44±0.84) ×109/L比较,差异无显著性意义(P>0.05)。

2.2 DDP用药后小鼠肾功能的变化

由表1可见，小鼠血BUN含量在DDP用药24 h后进行性升高,与对照组小鼠比较差异具有显著性意义(P<0.01)；而小鼠血CRE含量较对照组小鼠增高出现在DDP用药后48 h(P<0.01)。

表1 DDP用药后小鼠肾功能的变化

1)与对照组相比，P<0.01

2.3 外周血MPO含量的变化

DDP用药后小鼠外周血MPO含量的变化见图1。由图1可见，DDP用药后24 h内，小鼠外周血MPO含量较对照组略有降低，但差异无显著性意义(P>0.05)；DDP用药后48 h，小鼠血浆MPO含量升高达(39.58±4.04)U/L，与对照组(19.44±5.87)U/L比较，差异具有显著性意义(P<0.01)。

2.4 肾皮质匀浆组织蛋白含量

大剂量DDP用药后6、24、48h肾皮质匀浆中组织蛋白的含量分别为(9.35±1.67)、(10.58±0.94)、(8.63±2.78) mg/mL，与对照组肾皮质匀浆中组织蛋白(9.67±1.99)mg/mL比较，差异无显著性意义(P>0.05)。

图1 DDP用药后小鼠外周血MPO含量的变化

2.5 DDP用药后肾皮质匀浆MPO含量的变化

由图2可见，大剂量DDP用药后6 h，肾皮质匀浆中MPO含量为(0.29±0.08)U/g，DDP用药后24 h肾皮质匀浆中MPO含量升至(0.34±0.11)U/g，与对照组小鼠(0.13±0.03)U/g比较，差异具有显著性意义(P<0.01)；但DDP用药后48 h，肾皮质匀浆MPO含量降至(0.16±0.02)U/g，与对照组差异无显著性意义(P>0.05)。

图2 DDP用药后小鼠肾组织MPO含量的变化

3 讨 论

急性肾功能衰竭是肾脏本身或肾外原因引起肾脏泌尿功能急剧降低,以致机体内环境出现严重紊乱的临床综合征，是临床常见的危重病理生理过程。目前临床多采用水化利尿的方法来减少DDP肾毒性的发生，但统计显示，临床顺铂(DDP)化疗肾损害发生率仍高达25%～35%[7]，提示DDP肾毒性损伤的机制仍有待于进一步探索。

中性粒细胞(neutrophil)是体内数量最多的炎性细胞,来源于骨髓，释放后在血流中仅数小时便移出血管，具有很强的趋化、变形、粘附、吞噬和杀菌作用,在机体抗感染的病理过程中起非常重要的作用[8]。正常情况下，循环中的PMN处于非活化状态，必须在化学趋化因子或激活剂作用下粘附于内皮细胞表面活化，趋化PMN的化学因子有两类：一类是自身组织损伤释放的因子，如胶原和纤维蛋白片段、补体活化产物及免疫细胞因子等；另一类是微生物来源的含有N-早酰蛋氨酸残基的多肽。受趋化因子作用后，PMN表面的L-选择素(selectin)数量增加，血管内皮细胞开始表达P-或E-选择素，这两类选择素结合启动了PMN与内皮细胞粘附。随后，PMN迅速表达整合素(intergrin)，例如MAC-1和LFA-1等，与内皮细胞的配体结合可使PMN变扁，紧密粘贴内皮细胞。继而，PMN变形移出血管外向炎性或受损组织中浸润，活化的PMN脱颗粒或通过呼吸爆发生成大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS) 和其他炎症介质,参与机体对病原微生物的杀灭和清除，甚至引起组织损伤。目前研究表明，PMN产生ROS 的过程主要依赖于还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、MPO氧化酶系统。其中，MPO 是PMN嗜天青颗粒释放的过氧化物酶类,是PMN聚集的特征酶,是PMN脱颗粒的标志，其主要催化H2O2与Cl-起化学反应,产生次氯酸,后者具有很强的抗微生物活性[9]。Bradley 等[10]研究表明,MPO 的表达水平与PMN计数之间存在极显著相关性,并可作为PMN的功能标志。

本研究利用单一剂量DDP(12 mg/Kg)腹腔内注射制备小鼠急性肾损伤的动物模型[5]，结果发现DDP用药后48 h小鼠血BUN和CRE含量明显增高，与对照组小鼠比较差异具有显著性意义(P<0.01)，提示DDP用药后48 h小鼠出现急性肾功能衰竭。

通过检测大剂量DDP用药后48 h 内小鼠外周血WBC、PMN计数和PMN释放的MPO含量，结果发现：DDP用药后24 h内，伴随外周血WBC计数的降低，血MPO含量也逐渐下降，外周血WBC计数的下降与血MPO含量的降低相一致；同时，小鼠外周血涂片检查发现：DDP用药后24 h内小鼠外周血存在中性粒细脱颗粒现象。DDP用药后48 h，DDP用药组小鼠外周血WBC计数继续下降，与对照组比较差异有显著性意义(P<0.01)，但小鼠外周血涂片检查未见明显的PMN脱颗粒现象，两组小鼠外周血PMN计数比较差异却无显著性意义(P>0.05)；此时，DDP用药组小鼠血MPO含量明显高于对照组小鼠，差异均具有显著性意义(P<0.01)。由于MPO存在于PMN的嗜天青颗粒中，PMN激活时可释放MPO，从而使外周血MPO含量增加。本研究发现，DDP用药组小鼠外周血MPO活性升高出现的时间与大剂量DDP用药后小鼠急性肾功能衰竭出现的时间相吻合，提示大剂量DDP所致小鼠肾损害可能与PMN激活、大量释放MPO有关。通过检测10%肾皮质匀浆中的MPO含量，研究结果发现：DDP用药后6 h 小鼠肾皮质匀浆MPO含量明显升高，DDP用药后24 h 达高峰，为(0.34±0.11)U/g，与对照组小鼠(0.13±0.03)U/g 比较，差异具有显著性意义(P<0.01)；DDP用药后48 h肾皮质匀浆MPO含量下降，与对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。大剂量DDP用药后24 h内肾皮质匀浆MPO活性增高,提示大剂量DDP所致小鼠肾毒性损害早期，小鼠肾组织内存在PMN活化、脱颗粒并释放MPO。由于MPO可将H2O2与Cl-转为次氯酸,而次氯酸是强氧化剂，可氧化巯基，使氨基酸和蛋白质降解，从而造成肾组织细胞损伤。因此，DDP所致的急性肾损害可能与PMN释放髓过氧化物酶有关。

综上所述，大剂量DDP用药后24 h内小鼠外周血WBC数量明显下降。但外周血涂片可见PMN脱颗粒、肾皮质匀浆中MPO含量明显升高，考虑可能与DDP用药后PMN活化、聚集至肾脏、并大量释放MPO，引起肾损伤，最终导致小鼠出现急性肾功能衰竭。因此，大剂量DDP所致小鼠肾损害与PMN在肾皮质内的激活、释放有关，研究并开发抑制PMN活化的方法和措施，应有助于DDP肾损伤的防治。

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