亚慢性染砷对小鼠脑组织性基因Jarid1d表达的影响

齐 岩，朴丰源

(1.大连医科大学 附属第一医院 妇产科，辽宁 大连 116011； 2.大连医科大学 劳动卫生与环境卫生教研室，辽宁 大连 116044)

地方性砷中毒是世界性公共卫生问题之一。其中，砷对中枢神经系统的毒性作用已引起人们的高度关注。流行病学调查显示，高砷地区的儿童智商平均水平明显低于对照组[1]。动物实验表明，砷可以通过血脑屏障进入脑实质，慢性砷暴露的豚鼠和大鼠脑中砷浓度与暴露剂量呈显著正相关[2]。Rodriguez等[2]用雄性SD大鼠经口灌胃染砷2～4周后，观察到大鼠运动减少，在自我中心任务的行为测试中错误次数增多，延迟交替任务出现大量错误。这些神经行为学异常变化的结果,提示了中枢神经系统是砷毒性作用的敏感靶器官，但其作用机制尚不清楚。

Jarid1c是Jarid性基因家族成员之一，属于X染色体基因，携带雌性遗传信息，主要参与神经细胞的转录调控、染色质重塑和轴索发育。脑是Jarid家族基因表达的主要器官，Jarid1c突变可导致智力发育障碍[3]。因此，Jarid家族基因的功能可能与智力发育调控密切相关。

本研究用基因芯片和RT-PCR技术，检测了不同剂量亚慢性染砷小鼠的脑组织Jarid家族基因的表达，解析砷对这些基因表达的影响，为探讨砷的神经毒性机制提供新的研究思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

TRIzol 试剂盒(Invitrogen公司)；RNeasy Mini Kit (OIAGEN公司)；DEPC-Water (Ambion公司); Herring Sperm DNA (Promega公司); BSA (Invitrogen公司); MOPS (Sagon公司); β-Mercaptoethanol (Sagon公司); Normal Goat IgG (Sigma公司)；氯仿；异丙醇；乙醇；Quant cDNA 第1链合成试剂盒；2×Taq PCR MasterMix; 琼脂糖; EDTA-2Na; 硼酸。

1.2 设 备

GeneArrayTM扫描仪3000 (Affymetrix公司)、全自动芯片洗涤工作站450 (Affymetrix公司)、基因芯片杂交箱640 (Affymetrix公司)、Microarray Suite Version 5.0分析软件 (Affymetrix公司)等； 紫外分光光度计; PCR扩增仪；UVP凝胶电泳拍摄分析系统(美国UVP公司)。

1.2 实验动物及处理

健康昆明种小鼠30只，体重(20±2)g，由大连医科大学实验动物中心提供。按体重将小鼠随机分为3组，即生理盐水对照组、低剂量组(1 mg/L As2O3染砷组)和高剂量组(4 mg/L As2O3染砷组)。每组10只，小鼠正常饮食，连续染砷60 d。染毒结束后，将小鼠断头处死并立即取脑储存于RNA lazer 液中，低温保存。

1.3 总RNA的提取和基因芯片杂交

分别将各实验组和对照组的小鼠大脑和小脑在液氮中进行研磨，依TRIzol 试剂盒操作说明从脑组织中抽提总RNA，用RNeasy Mini Kit进行纯化。提取的RNA在紫外分光光度仪下测定RNA的浓度和纯度，同时变性胶电泳检测RNA有无降解；然后反转录成cDNA，用RNA转录标记试剂盒进行体外转录合成cRNA探针，合成的同时进行生物素标记；生物素标记的cRNA探针经片段化处理后与Mouse Genome 430 2.0 Araay基因芯片在杂交箱640中45℃杂交16 h，然后于全自动芯片洗涤工作站450中洗脱、染色；最后用GeneArrayTM 扫描仪3000扫描杂交信号。

1.4 芯片数据处理和生物学信息分析

杂交结果用Affymetrix公司的Microarray Suite Version 5.0软件进行分析。在对单个样本表达分析的前提下，根据P<0.04为表达，0.04～0.06为临界，P>0.06为不表达，分别建立对照组、低剂量组，高剂量组小脑组织的基因表达谱；然后将二者的基因表达谱进行比较，根据signal log ratio (SLR)值判断。SLR>1(即表达倍数>21)为表达上调，SLR<-1(即表达倍数<2-1)为表达下调。筛选得到在对照组、低剂量组，高剂量组中差异表达的基因探针号输入NetAffy网站 (www.affymetrix.com)中进行批量处理查询 (Batch Query)，查询出相对应的基因和生物学信息。

1.5 RT-PCR检测方法

按试剂盒说明提取总RNA，RT-PCR反应条件，Jarid1d：94 ℃变性3 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃充分延伸7 min。β-actin ：94 ℃变性3 min,94℃变性30 s,58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃充分延伸7 min。RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统照相，并同β-actin结果比较。引物设计见表1。

表1 引物设计

1.6 统计学方法

用SPSS12.0统计软件进行分析,用方差和LSD检验分析PCR检测的mRNA表达相对值(辉度值)的多组间差异,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 染砷小鼠脑组织Jarid1d表达的基因芯片分析

与对照组比较，低剂量组和高剂量组小鼠大脑组织Jarid1d基因表达分别为29.9和34.3倍，小脑组织分别为9.2和13.9倍，均显著上调(表达倍数>2)(表2)。

表2 染砷小鼠脑组织Jarid1d表达的基因芯片结果

2.2 染砷小鼠大脑皮质Jarid1d表达的RT-PCR检测

就Jarid1d基因表达，用RT-PCR做了进一步验证检测。如图1所示，高剂量染砷组大脑皮质Jarid1d的表达明显高于对照组和低剂量染砷组(P<0.05)。β-actin表达差异无显著性意义。

图1 染砷小鼠大脑皮质Jarid1d差异表达的RT-PCR结果

2.3 染砷小鼠大脑髓质Jarid1d表达的RT-PCR检测

如图2所示，RT-PCR的验证检测结果表明，高剂量染砷组大脑髓质Jarid1d的表达显著高于对照组和低剂量染砷组(P<0.01)。β-actin表达差异无显著性意义。

图2 染砷小鼠大脑髓质Jarid1d差异表达的RT-PCR结果

2.4 染砷小鼠小脑Jarid1d表达的RT-PCR检测

如图3所示，RT-PCR的验证检测结果表明，高剂量染砷组小脑组织Jarid1d的表达显著高于对照组和低剂量染砷组(P<0.01)。β-actin表达差异无显著性意义。

图3 染砷小鼠小脑Jarid1d差异表达的RT-PCR结果

3 讨 论

流行病调查和动物试验研究已经证明，砷是一种具有神经毒性的化学物，当人和动物被暴露时可影响脑的学习和记忆功能[1,5]。脑是一个结构和功能最为复杂敏感的器官，其学习记忆功能受包括神经递质在内的体内诸多因素的调控。当这些调控过程受到某些因素的干扰时，会影响脑的正常学习记忆功能，导致智力低下。

有文献报道，Jarid1c参与调节脑的学习记忆功能等多种生物学过程[3]。Xu等[6]研究发现，Jarid家族基因在脑中大量表达，参与调节脑的功能。这些文献表明，任何能使Jarid家族的基因或蛋白在脑中的正常表达受到影响的因素，都可能导致神经行为的异常表现。本研究的基因芯片筛选结果显示，亚慢性染砷没有引起Jarid1c在小鼠脑组织的异常表达。相反，砷导致Jarid家族的另一个基因Jarid1d在脑组织显著上调。即与对照组比较，低剂量组和高剂量组的小鼠大脑中Jarid1d表达分别为29.9和34.3倍，小脑中分别为9.2和13.9倍。这一结果，引起本课题组的极大兴趣。所以用RT-PCR技术做了进一步的验证实验。发现高剂量染砷组小鼠大脑皮质、髓质及小脑组织中Jarid1d的mRNA表达均高于对照组，与基因芯片的结果相吻合。这些结果提示，亚慢性染砷可明显上调Jarid1d在小鼠脑组织的表达。Jarid1d和Jarid1c为同一家族的两个成员，是一种与Jarid1c对等的Y染色体性基因，携带雄性遗传性状信息，被认为具有与Jarid1c基本相同的功能[6]。因此，亚慢性染砷对Jarid1d在脑组织表达的影响应该引起关注。

亚慢性砷暴露可影响小鼠脑组织Jarid1d基因的表达，提示Jarid1d可能是砷的神经毒作用靶基因。今后进一步从蛋白质水平验证亚慢性染砷对脑组织Jarid1d表达的影响，同时通过一系列干预实验探讨砷对小鼠脑组织Jarid1d基因表达的影响与小鼠学习记忆及行为功能异常之间的因果关系是非常必要的。

[1] Rodríguez VM,Jiménez-Capdeville ME,Giordano M.The effects of arsenic exposure on the nervous system[J].Toxicol Lett,2003,145(1):1-18.

[2] Rodríguez VM,Carrizales L,Jiménez-Capdeville ME,et al.The effects of sodium arsenite exposure on behavioral parameters in the rat[J].Brain Res Bull,2001,55(2):301-308.

[3] Jensen LR,Amende M,Gurok U,et al.Mutations in the Jarid1c gene,which is involved in transcriptional regulation and chromatin remodeling,cause X-linked mental retardation[J].Am J Hum Genet,2005,76:227-236.

[4] Iwase S,Lan F,Bayliss P,et al.The X-linked mental retardation gene SMCX/JARID1C defines a family of histone H3 lysine 4 demethylases[J].Cell,2007,128:1077-1088.

[5] Wang Y,Li S,Piao F,et al.Subchronic exposure to arsenic downregulated the expression of Camk4 as an important gene related to the late phase of cerebellar LTD of mice[J].Neurotoxicol Teratol,2009,31(5):318-322.

[6] Xu J,Deng X.Disteche CM.Sex-specific expression of the X-linked histone demethylase gene Jarid1c in brain[J].PLoS ONE,2008，3(7):e2553.