肝细胞生长因子对面神经损伤模型大鼠面肌TGF-β表达的影响

刘烨 骆文龙 陈利涛

面神经周围段由于其位置表浅，外伤、炎症、手术和肿瘤等易造成其损伤，而目前面神经损伤后的治疗仍是临床医学中所面临的难点问题之一。大多数学者认为面神经损伤后修复的难点主要有以下两点[1]：一是如何防止面神经损伤后的神经元死亡，即如何替代已经死亡的神经细胞；二是如何抑制面神经损伤后失神经支配的骨骼肌纤维化，从而有利于神经轴突再生及其收缩功能的恢复。前者目前最理想的方法只有通过干细胞移植，然而很难用于临床；后者则通过抑制面神经损伤后面颊肌的纤维化来实现，相对于前者可行性更高。文献报道[2]肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)通过促进上皮细胞增殖、抑制上皮细胞凋亡及促进胶原降解、抑制胶原合成，参与肝、肾、心、肺等多种器官的结构重建，起器官保护作用，是少数能够阻止器官纤维化的生长因子之一。既往研究[3，4]从形态学、神经电生理方面证实外源性的HGF(10 μl)对面神经损伤后神经干、神经元、肌运动终板都有保护作用。Yuichi等[5]从功能上和组织学上观察到转基因的HGF能促进撕脱伤后的运动神经元恢复。本实验通过建立面神经钳夹伤模型，利用免疫组化及Western blot技术，研究HGF对面神经损伤后面颊肌转化生长因子-β(TGF-β，最强的促胶原生成因子)的影响，探讨HGF是否能通过抑制面颊肌的纤维化来实现其对神经损伤的保护作用及其具体机制。

1 材料与方法

1.1试剂与设备 玻璃匀浆器(宁波新芝DY89-1)、高速离心机(湖南湘仪H1650-W)、分光光度仪(上海欣茂UV-7504)、垂直板电泳转移装置(上海天能生物)、电泳仪(北京君意JY300C)、多用脱色摇床(苏州捷美SYC-2101)，单去污剂裂解液(北京普利莱生物)、0.01 mol/L PBS (pH 7.3)、10%分离胶、4%浓缩胶、0.15 mol/L NaCl 溶液、5XSDS 上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、封闭液、TBST、TBS、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂，鼠抗-TGF-β(购于上海sigma公司)二抗试剂盒(购自Dako公司)，重组人类肝细胞生长因子1mg(购于百萃生物科技有限公司)。

1.2动物分组及实验方法 30只SD大鼠(体重220～280 g)购于重庆医科大学动物实验中心，饲养于12小时光照/12小时黑暗的环境，自由进食。随机分成三组：对照组、生理盐水组和HGF组，每组10只。

1.2.1面神经钳夹伤模型的建立[6]及治疗 三组动物分别制作右侧面神经钳夹伤模型，动物以10%水合氯醛腹腔注射(3 ml/kg)麻醉后，切开皮肤、皮下组织，仔细分离右侧面神经颊支，用显微外科镊钳夹其近心端(以镊子第一扣为准，均为同一实验者操作)10秒钟后，HGF组和生理盐水组分别在面神钳夹处周围填入浸满HGF或生理盐水10 μl的医用胶原蛋白海绵块，然后逐层缝合，术后连续3天腹腔注射青霉素预防感染，对照组不做任何治疗。连续观察大鼠胡须的运动方向1个星期(初步判断面神经的损伤程度)。1月后(既往研究证实面神经损伤后1月左右面颊肌纤维化最明显)[3,4]取右侧面颊肌，行免疫组化染色及Western blot实验检测TGF-β的表达。

1.2.2免疫组化方法 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速取完整大鼠面颊肌，称重后放入多聚甲醛4 ℃冰箱保存24小时，常规脱水、包埋、切片。免疫组化染色步骤为：①常规脱蜡，梯度酒精脱水；②过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性；③抗原修复；④抗原封闭；⑤加适当稀释一抗(50 μl)；⑥滴加二抗；⑦滴加HPR液；⑧滴加DAB显色液、复染、封片，各步骤之间用0．01 mol/L PBS充分洗涤；⑨复染，每只大鼠在相似层面各取1～3张片子，利用显微图像分析系统，在200倍物镜下，对面颊肌TGF-β表达平均光密度进行计算分析(阳性产物为棕黄色或棕褐色，背景为蓝色)。

1.2.3Western blot实验 按照蛋白提取液说明书提取蛋白。取适量蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转到PVDF膜上，转膜后在5%的脱脂牛奶中进行封闭，然后加鼠抗-TGF-β(1：3 000)，温育1.5小时。用TBST清洗3次，每次5分钟，用封闭液将二抗稀释成一定的浓度(1:5 000)，温育1.5小时，用TBST清洗4次，每次5分钟。化学发光，显影，定影，对胶片进行扫描，最后用UVP凝胶图像处理系统Labworks4.6软件分析目的条带的灰度值，实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1面神经钳夹伤后HGF对面颊肌湿重的影响 对照组面颊肌湿重为1.954±0.119 g，与生理盐水组(1.952±0.104 g)比较差异无统计学意义(P>0.05)),HGF组面颊肌湿重为1.791±0.095 g，与前两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2HGF对面颊肌TGF-β表达的影响 HGF组面颊肌肌纤维比较清晰，TGF-β有散在表达，而对照组、生理盐水组面颊肌肌纤维排列较杂乱，TGF-β表达聚集(图1)。HGF组TGF-β免疫化学累计光密度明显低于对照组及生理盐水组(P<0.01)，而对照组与生理盐水组之间差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

表1 三组TGF-β免疫化学累积光密度

注：与其他两组比较，P<0.01

2.3Western blot检测TGF-β蛋白表达结果 West blot检测发现，HGF可抑制TGF-β蛋白的表达，生理盐水对TGF-β无明显影响(图2)。用Labworks4.6软件分析TGF-β蛋白的相对表达率，对照组、生理盐水组、HGF组TGF-β蛋白的相对表达率分别为36.4%±4.4%、36.7%±3.8%、15.1%±2.9%，HGF组较对照组及生理组TGF-β蛋白表达明显减少(P<0.01)，而生理盐水与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 三组动物面颊肌 TGF-β表达情况 a 对照组；b 生理盐水组;c HGF组。箭头所示为TGF-β阳性表达(SP×200)

图2 Western blot检测三组面颊肌TGF-β蛋白的表达

3 讨论

HGF属于纤溶酶原依赖的生长因子家族，是一种可溶性的细胞因子，最初认为它仅能刺激肝细胞增生，现已被证实其具有多种功能，在全身多处均有表达，它不仅是神经外组织细胞的分裂原、运动因子、成型索，而且还对大脑及外周神经系统的发育和维持、轴突靶向分布以及轴突生长有一定作用。HGF可以通过自分泌、旁分泌以及经典的轴突逆向运输的方式保护神经元和轴突再生，促进雪旺细胞的分裂，抑制纤维瘢痕的生长[7]。神经损伤后HGF在中枢分泌较少，而在靶组织大量增加，故在外周神经损伤时，局部应用HGF更有意义[8]。哈小琴等[9]报道局部应用HGF可促进皮肤愈合，还可促进皮肤中附属器的形成，故本实验采用局部应用HGF观察其对面神经损伤后修复的影响。

目前研究[10]认为TGF-β是最强的促胶原生成因子，与心、肝、肾纤维化进程密切相关，其作用表现在活化的TGF-β能使肾小管上皮细胞、肝星状细胞和心肌细胞分化为成纤维细胞，促进其生成大量纤维蛋白和I型、Ⅲ型胶原蛋白，同时抑制胶原酶释放，阻滞基质蛋白降解，使细胞外基质合成与降解失衡，最终发生心、肝、肾等器官纤维化。任国山等[11]研究表明，HGF对新生大鼠受损的面运动神经元有保护作用。 Mou等[12]发现HGF通过减少肾脏TGF-β的表达来抑制肾脏的纤维化。大量的实验证实[13～15]在心脏、肺、肝脏，HGF同样通过抑制TGF-β的表达减少器官的纤维化，从而促进器官的功能修复。本实验在大鼠面神经损伤后局部使用HGF同样是拟通过抑制面颊肌的纤维化来促进神经损伤的修复。

本实验在大鼠面神经钳夹伤后局部应用HGF，通过比较三组面颊肌湿重、免疫组织化学染色和Western blot检测结果发现，HGF组TGF-β蛋白表达较对照组及生理盐水组明显减少，可见，HGF可通过减少失神经支配后面颊肌TGF-β的表达来抑制面颊肌的纤维化，从而促进面神经损伤后的修复，这对临床上局部应用HGF治疗各种面神经损伤具有重要意义，但HGF对TGF-β整个信号通路存在何种影响以及HGF是否还通过减弱其它胶原生成因子的表达来促进神经损伤后的修复，有待进一步研究。

(致谢：衷心感谢重庆医科大学附动物实验中心的全体老师在实验中给予的无私帮助！)

4 参考文献

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3 周翠英，骆文龙.肝细胞生长因子对面神经损伤修复作用的实验初探[J] . 重庆医学,2003，32:299.

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5 Yuichi H，Yoko K, Tsuyoshi S, et al.Adenoviral gene transfer of hepatocytegrowth factor prevents death of injured adult motoneurons after peripheral nerve avulsion[J] . Brain Research,2006 ,1 111： 187.

6 丁浩 ，鲁飞 ，赵霞,等.微波促进大鼠面神经机械性损伤的修复作用[J] . 中国临床康复,2005,9:62.

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8 Boros P，Miller C．Hepatocyte growth factor：A multi—functional cytokine [J] ．Lancet，1995，345：2 913.

9 哈小琴，吕同德，王娟,等.肝细胞生长因子促皮肤愈合及其对皮肤附属器的作用[J] . 兰州大学学报(医学版) ,2008,34:21.

10 Tetsuro W, Kohei M. Roles of TGF-β family signaling in stem cell renewal and differentiation[J] . Cell Research,2009,19:103.

11 任国山，赵长义，张喜平,等.肝细胞生长因子对新生大鼠受损面神经运动神经元的营养作用[J] .解剖学杂志,2004,27：284.

12 Mou S，Wang Q, Shi B, et al.Hepatocyte growth factor suppresses transforming growth factor-beta-1 and type III collagen in human primary renal fibroblasts[J] .The Kaohsiung Journal of Medical Sciences, 2009,25:577.

13 Tetsuro W,Kohei M. Roles of TGF-βfamily signaling in stem cell renewal and differentiation[J].Cell Research,2009,19:103.

14 吴芳，杨方，王小君，等.AcSDKP对TGF-β1诱导的大鼠心脏成纤维细胞胶原蛋白合成及表达的调节作用[J].解剖学报，2007，38：708.

15 杨俊玲，吴艳峰，董春玲，等.肺纤维化小鼠肺泡灌洗液及肺组织中IL-10和TGF-β1的动态表达[J].吉林大学学报医学版，2005，31：536.