聚苯乙烯核-聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)壳荧光素微球制备方法的研究

姚晚侠,杨 彪,李 群,孙耀杰

聚苯乙烯核-聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)壳荧光素微球制备方法的研究

姚晚侠1,2,杨 彪3,李 群3,孙耀杰3

(1.西安交通大学医学院第一附属医院,陕西西安 710061;2.西安交通大学生命科学与技术学院,陕西西安 710049;3.复旦大学信息科学与工程学院,上海 200433)

目的：为制备性能良好的核壳结构荧光微球,探讨了加料方式、引发剂选择、交联剂使用、pH调节、浓度配比和溶胀处理等反应条件对形成壳结构的效果以及形态学上的影响。方法：通过以乳液聚合得到的荧光素微球为核,以丙烯酰胺、丙烯酸为壳结构的聚合单体,制得了聚苯乙烯核-聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)壳荧光素微球。结果：荧光显微镜显示：粒径均一,分布范围 7～8μm。红外吸收光谱证实了聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)壳结构以及表面酰胺基的存在。该种子聚合反应的最佳条件为：在不使用交联剂的前提下以偶氮二异丁腈为引发剂,经过 40 h的乙醇溶胀处理,70℃反应 3 h,反应过程 pH值在 6～7之间。该荧光微球的平均载药量和包封率分别为 25.14%和90.21%,其荧光释放率 40 h后稳定在 30%左右。结论：用此法制备的微球具有良好的荧光性能和明显的核壳结构,分散性和稳定性良好,其载药量和包封率也相对稳定,并具有良好的缓释性能。

微球体;荧光素类;丙烯酰胺 /化学;聚苯乙烯 /化学;聚合物;乳状剂;工艺学,制药

[J Zhejiang Univ(Medical Sci),2011,40(1)：44-50.]

随着生命科学和荧光分析技术的发展,荧光分析已经渗入到了生物学和医学的各个领域,包括生物物理学、生理学、生物化学、分子生物学、药理学、免疫学、细胞学、遗传学等。从研究的材料来看,包括氨基酸、蛋白质、核酸、维生素、酶、药物、毒物等多种物质。尤其随着荧光显微镜和流式细胞仪以及激光扫描共聚焦显微镜的出现,荧光探针在细胞标记[1]、药物筛选、蛋白检测、DNA检测、生物膜结构和动力学,以及膜结构和膜通透性等方面已经得到了广泛的应用[2]。核壳结构的高分子微球,是一种由中心粒子为核,不同组分为壳层而组成的具有特殊结构的聚合物粒子,核与壳分别富集不同的化学成分[3]。由于核壳高分子微球的核、壳之间可能存在接枝、互穿或者离子键合,它不同于一般的共聚物或聚合物共混物,在相同原料组成的情况下,微球的核壳结构化可以显著提高聚合物的耐磨、耐水、耐候、抗污、防辐射性能,以及抗张强度、抗冲强度和粘接强度,改善其透明性,并可显著降低最低成膜温度,改善加工性能。近年来,人们通过化学和物理的手段 (如交联、包埋、附着和反应)赋予核壳高分子微球以光导、电导、热敏和磁性等功能,并广泛应用于电子、生物、医药和塑料、涂料、复合材料等许多领域。因此,核壳高分子微球作为一种新型材料,具有重要的应用价值和前景,已成为近年来高分子领域的研究热点[4]。但是,目前纳米核壳结构的制备工艺尚不够完善,形成机理认识还不够深入[5]。而且,国内该领域的研究重点主要集中在以下几个方面：①通过结构方面的研究,完善核壳结构粒子的形成机理;②通过调节复合粒子的结构、形态和大小,使结构和物质组成多元化,粒径与形态特殊化,进一步开拓材料性能;③研究表征核壳结构纳米复合粒子的新技术;④拓宽研究开发体系,改进合成方法,使应用得以产业化,更好地满足人们的需求[6]。

考虑到生物医学等领域的应用要求,荧光素微球必须具备生物相容性[6]、水溶性、可与蛋白质等生物大分子交联等特性。这就在某种程度上限制了制备的方法和所使用的材料,再加上工业生产要求工艺放大等后续工作,在合成时间的长短、反应条件的苛刻与否、成本等因素的约束。因此,本研究将壳结构的单体确定为水溶性很好、有氨基、易获得的丙烯酰胺,并以聚苯乙烯荧光素微球为核,经过溶胀法处理之后,以聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)为壳制备了核-壳结构的荧光素微球。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 荧光素 (Flu,分析纯,沈阳市试剂三厂),丙烯酰胺 (AAM,优级纯,常州利安化工有限公司),丙烯酸 (AA,分析纯,天津化学试剂三厂),过硫酸钾 (KPS,分析纯,西安化学试剂厂),偶氮二异丁腈 (A IBN,化学纯,上海山浦化工),N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 (MBA,分析纯,西安化学试剂厂),苯乙烯 (St,分析纯,西安化学试剂厂)等。HH-2电热恒温水浴锅 (北京科伟永兴仪器),JJ-1精密增力电动搅拌器(常州国华电器),CL-4A磁力加热搅拌器 (郑州长城科工贸),AnkeTGL-16C离心机 (上海安亭科学仪器厂),循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸),CX41科学显微镜 (Canon A 650,Olympus),M illipore去离子水机 (M illi-Q)。

1.2 方法

1.2.1 苯乙烯荧光素微球的制备过程 在通有氮气导管的三口瓶中分别加入 30 ml水、5 ml St、3 ml Eth和 25 mg Flu,在 70℃、200 r/min下搅拌,随后加入 0.2 g KPS引发体系。整个过程由氮气保护,5 h后停止反应,将产物透析,备用。苯乙烯-荧光素微球的制备方程式[7]：

1.2.2 反应条件

1.2.2.1 加料方式及单体浓度 用半连续(饥饿态)加料法做对比实验。①预处理：20 ml苯乙烯-荧光素微球 +2 ml乙醇 +0.2 g KPS+1.0 g AAM+5 ml水,超声处理 10 min使 KPS完全溶解,并通 N2保护。将 0.5 g AAM溶于 9 ml去氧水中 (2.0 g溶于 12.5 ml去氧水中作对比);②种子聚合：水浴温度达到 70℃时加入混合液,并不断调节 pH至 6～7,待 pH不再明显变化时开始滴加 AAM溶液,每 5 min加 0.5 ml。5 h后停止反应,在反应过程中每 30 min镜检 1次。

1.2.2.2 引发剂的选择 预处理两组平行样品,A组：15 ml荧光微球 +10 ml乙醇 +0.5 g AAM+0.1 g A IBN;B组：15 ml荧光微球 +10 ml乙醇 +0.5 g AAM+0.1 g KPS。将 0.5 g AAM溶于 9 ml去氧水中备用,A组和 B组反应 30 min后分别加入 50μl AA,2 h后加 AAM溶液,0.5 ml、30 min,在反应过程中每 30 min镜检 1次。

1.2.2.3 交联剂的使用 预处理：15 ml荧光微球 +10 ml Eth+0.5 g AAM+0.1 g A IBN。30 min后加 50μl AA,40 min后加入 0.01 g MBA,在反应过程中每 30 min镜检 1次。

1.2.2.4 pH的调节 预处理同 1.2.2.1,加入丙烯酸后不调节 pH,3 h后继续反应,在反应过程中每 30 min镜检 1次。

1.2.2.5 微球浓度的选择 预处理：15 ml St微球 +10 ml Eth+0.5 g AAM+0.1 g A IBN,种子聚合方法同 1.2.2.2节,在反应过程中每 30 min镜检 1次。

1.2.2.6 溶胀效果 按 1.2.2.1节预处理组分,直接将微球进行种子聚合,在反应过程中每30 min镜检 1次。按预处理组分加入各试剂,放置 24 h,按 1.2.3.2节步骤合成,在反应过程中每 30 min镜检 1次。

1.2.3 最优制备方法

1.2.3.1 预处理 将 1.2.1节中得到的苯乙烯荧光素微球进行预处理：向 100 ml烧杯中加入去离子水,用磁力加热搅拌器加热至沸腾,保持沸腾状态 2 min后停止加热,并加盖静置至室温,得到去氧水备用。向锥形瓶中依次加入5 ml荧光素微球、20 ml乙醇、1.5 g AAM、0.3 g A IBN和 10 ml去氧水,振荡均匀后放入 4℃冰箱 40 h左右。

1.2.3.2 种子乳液聚合 将三颈瓶和搅拌棒固定在精密增力电动搅拌器下,并向三颈瓶中加入 10 ml去氧水,置于 70℃水浴锅中。水浴加热到 60℃时,通入 N2排出空气。待水浴温度达到 70℃时开启搅拌器,将经过预处理的混合液逐滴加入至三颈瓶中,用黑塑料袋将三颈瓶盖住避光。反应 30 min后,加入 50μl AA,并用 1 mol/L的 NaOH溶液调节 pH至 7左右,3 h后停止反应。

2 结 果

2.1 反应条件探究

2.1.1 加料方式的影响 在半连续 (饥饿态)加料实验过程中,发现有部分不理想的核壳式结构出现,而且体系黏度不断增大 (图 1)。

2.1.2 引发剂选择的影响 在引发剂的探究实验中,以 KPS为引发剂时几乎没有成型的壳,而以 A IBN为引发剂,反应 150 min左右时出现了大量的、明显的具有核壳式结构的微球,而且体系黏度大。

图1 半连续加料条件下的核壳式荧光素微球Fig.1 Polystyrene core-poly (acrylamide acrylic acid) shell fluorescent microspheres under condition of semicontinuous feeding

2.1.3 交联剂使用的影响 受到聚丙烯酰胺凝胶电泳做胶过程所用方法的启发,考虑能否加入交联剂 N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 (MBA),使AAM分子在聚合过程中由线状变成网状,从而更有利于成壳式的碰撞和附着。基于以上想法设计了对比实验,结果是反应 2～3 h后体系黏度急剧增大,溶液成稀胶水状,放干后出现一层凝胶,甚至影响光镜下对微球的观察。

2.1.4 pH调节的影响 加入丙烯酸后若不调节 pH则体系为酸性 (pH≈3),反应前 3 h内有少量核壳结构荧光素微球产生,但在 3 h后,微球逐渐破裂直到最后完全分散,观察不到微球的存在。

2.1.5 浓度配比的影响 在浓度的探究实验中,反应过程中只发现有个别微球有很好的壳结构,大部分微球仍然保持原来的核的形态。随着反应的进行,微球开始出现凝聚现象。

2.1.6 溶胀效果 不进行溶胀处理的一组,几乎没有核壳结构生成。溶胀处理 24 h后进行种子聚合的一组,3 h后部分微球有明显的核壳结构生成,但大部分仍然保持核的结构。

2.2 粒径分析

2.2.1 苯乙烯-荧光素核 按照 1.2节所述方法制备的苯乙烯荧光素微球形态规则,粒径约为 1μm,且分布较为均一,在溶液中分散性好,无团聚现象,在荧光显微镜下可以观察到足够的荧光性 (图 2),可以用作制备高分子壳的种子。

图2 苯乙烯-荧光素微球的光镜照片Fig.2 Optical microp ho to of polystyrene fluoresce in microspheres

2.2.2 丙烯酰胺-丙烯酸壳 本实验产物大致形成了 4种结构的球：①原来的核上已有十分明显的壳结构;②核不在核-壳式微球正中间的结构;③2个甚至更多的核被包在一起的结构;④没有包上或者正在包的荧光核 (图 3)。这都直接或间接地证明了视野中所看到的大量的微球是核壳结构的荧光素微球。

图3 苯乙烯核-(丙烯酰胺-丙烯酸壳)荧光素微球的光镜照片Fig.3 Optical microphoto of polystyrene corepoly (acrylamide-acrylic acid) shell fluorescentmicrospheres

2.3 荧光性质表征 在荧光激发光和普通光下用显微镜对得到的产物进行表征 (图 4)。通过对比可知,制得的核-壳微球荧光性能良好。微球与溶液背景颜色反差较大,即溶液中荧光素浓度较低,说明核-壳结构可以较好地解决荧光泄漏的问题。

图4 同一视野下的荧光光源和普通光源显微照片Fig.4 Microphotos polystyrene core-poly(acrylamide-acrylic acid) shell fluorescent microsp heres with and without fluorescence under the same visual field

2.4 红外吸收光谱分析 分别将苯乙烯荧光素微球核和制得的经过透析处理的具有核-壳结构的苯乙烯荧光素微球在真空干燥仪中干燥后进行傅里叶变换红外光谱 (FT-IR)分析,得到的红外吸收光谱 (图 5)。

图5 苯乙烯核与核壳微球的红外吸收光谱Fig.5 Infrared absorption spectrum of polystyrene core and core-shell microsp heres

从种子核的谱图上：698 cm-1和 756 cm-1处有 2个大的吸收峰,这是苯环的 C-H面外弯曲振动峰;同时 ,在 1 450 cm-1和 1 490 cm-1处也有较大的吸收峰,这是苯环的骨架振动吸收峰,在 2 850 cm-1和 2 920 cm-1处的吸收峰为饱和 C-H的伸缩振动吸收峰;在3 024 cm-1、3 049 cm-1和 3 059 cm-1处的吸收峰为不饱和C-H的伸缩振动吸收峰;在1 727 cm-1,1 871 cm-1和 1 938 cm-1范围内一系列较弱的吸收峰为苯环 C-H键弯曲振动的倍频和组频峰。这都证明了 St核中苯乙烯的存在。而核壳微球中这几组却缺失了,可见 St核确实被包裹在核壳微球之中,甚至产生了一定的变化。从图中还可以看到,在 3 462 cm-1处有一个宽化的强吸收峰,为 O-H和 N-H的重叠伸缩振动吸收峰;1 652 cm-1处的强吸收峰为 C=O的振动吸收峰,这表明羧基和酰胺基的存在。另外,在宽峰处,核壳微球比 St核吸收率高,表明 St壳有更多的氨基,进一步说明了丙烯酰胺确实被包裹在了核的表面上。

2.5 稳定性 分别将体积分数为 0.10的 HCl、1 mol/L NaOH、20 g/L NaCl、体积分数为 0.95的C2H5OH等体积加入所制备的乳液中,振荡,将所得乳液置于 4℃冰箱,800 h后观察。没有发现絮凝或沉淀,可判断乳液体系稳定。

2.6 缓释性能 采用动态渗析法测定荧光微球乳液中荧光素的释放情况。精确称取荧光微粒乳液 0.5 g,加入 30 ml双蒸水及 20 ml pH=7.4的磷酸盐缓冲液,搅拌后置于渗析袋内,渗析袋置于 500 ml pH=7.4的磷酸盐缓冲液,将其置于 37℃恒温箱中,100 r/min磁力搅拌,按时于 0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、32 h、64 h、100 h和 128 h,取 10 ml袋外磷酸盐缓冲液进行荧光素含量测定,每次取样后补加 10 ml磷酸盐缓冲液。测得的荧光释放曲线如图 6。

图6 核壳荧光微球的荧光释放曲线Fig.6 Fluorescein release curve of core-shell fluorescent microsp here

2.7 载药量及包封率测定 精密称取适量制得的核壳结构荧光微球,置于 100 ml量瓶中,用 pH 6.8 PBS溶液溶解,超声处理 10 min,稀释至刻度,摇匀并静置,经 0.45μm醋酸纤维素微孔滤膜滤过、备用。精密吸取滤液 2 ml置于 50 ml量瓶中,用上述 PBS溶液稀释至刻度,摇匀,根据标准曲线方程计算药物质量浓度,并按下式计算载药量和包封率。

载药量 =样品中荧光素的质量/样品量×100%;

包封率 =微粒中荧光素的质量/投药量×100%。重复 3次测量所得的载药量分别为24.37%、25.16%和 25.89%;包封率分别为91.25%、89.32%和 90.06%。

3 讨 论

3.1 加料方式对实验结果的影响 在半连续(饥饿态)加料实验中,发现有部分不理想的核壳结构,而且体系黏度不断增大,其产生的原因可能有 2点：①起始 AAM浓度已经足够,之后加入的AAM溶液只增加体系中AAM的浓度,从而加快了 AAM的自聚,而对核表面的环境影响不大;②水溶性的 KPS引发剂从预处理步骤开始就一直分散在混合溶液中,在温度升高之后导致溶液体系中丙烯酰胺的自聚,而不是在种子核表面聚合,导致体系黏度不断增大。后加入的 AAM溶液会导致 AAM在溶液中形成聚丙烯酰胺,使体系浓度增大,从而影响了壳结构形成的理化环境。而且,半连续加料反应时间长,实验操作工作量大,需要不断的补充原料,从而导致实验及工艺的可重复性差。这些都有可能给之后的工艺放大和工业化生产带来极大的不便和障碍。

3.2 不同引发剂对实验结果的影响 ①水溶性的 KPS引发剂从预处理步骤开始就一直分散在混合溶液中,在温度升高之后导致溶液体系中丙烯酰胺的自聚,而不是在种子核表面聚合,导致体系黏度不断增大;②油溶性的 A IBN引发剂在预处理过程中没有分散在混合体系当中,而是由于其水溶性差的性质,在混合体系中均匀地分散在了种子微球表层的非极性物质当中,反应开始后,少量附着在微球表面及附近的AAM单体在 A IBN的作用下进行自由基聚合,然后体系中的丙烯酰胺不断补充到微球表面,聚合反应继续进行,从而使壳不断加厚;③乙醇具有溶胀作用,可以把 A IBN和 AAM单体带入微球表面甚至表面以下更深入的部位,有利于聚丙烯酰胺壳的形成。在水溶性体系及 AAM这种水溶性单体的环境下,要阻止 AAM单体在水相中聚合,使用 A IBN目前看来是很可行的方法。按照这个想法,如果使用一种如丙酮、四氯化碳的非极性溶剂来浸泡和溶胀种子微球,可以让丙烯酰胺聚集到微球表面;从理论上来说,这可能会有较好的效果,但是存在工艺放大、工业化生产及实验安全方面的问题。

3.3 交联剂的使用 交联剂使 AAM单体在引发剂的作用下形成了网状结构,但网状结构没有象预想的那样,能较好地附着在种子微球上,而更多的可能是在相互碰撞形成更大分子量的聚丙烯酰胺,造成 AAM单体在比单独使用 KPS为引发剂的条件下更快地聚合,导致体系黏稠。

3.4 pH的调节 对比微球合成时的条件,分析可能原因：①制作种子核时,pH应调节在 6～7之间,否则无法成球,因此 pH在酸性条件下不利于保持微球的原始形态,反应时间长会使微球破裂、分散;②pH从机制上影响自由基产生的速率,并影响链延长过程中自由基的传递,从而影响整个聚合反应,所以合成效果远不如控制 pH为中性时。

另外发现,KPS在分解形成自由基的过程中,会产生 H+,使 pH降低,在反应过程中 pH不断变化,需要不断地加入 NaOH才能使 pH保持稳定,而 A IBN在引发聚合反应的过程中不会改变体系 pH。因此使用 A IBN只需在加入AA之后调节一次 pH即可。

3.5 微球浓度的选择 关于浓度对反应有影响的原因很显然,AAM单体、A IBN的不足自然不会引起大量的壳结构形成,同时,个别很好的壳的存在,也说明了反应条件对于壳的形成还是很温和、有利的。凝聚现象的产生则可能是因为原料浓度过低,在种子表面形成很薄而且不均一、不完整的薄壳,导致微球之间的互相黏合。而在半连续 (饥饿态)加料法的实验中,也曾尝试过反应过程中加 AAM溶液,根据多次反应过程中经验性的效果,再加上种子微球来源单一,浓度稳定,因而摸索出了种子聚合的最佳浓度。

3.6 溶胀效果 因为溶胀的速度比较慢,需要浸泡比较长的时间才能使微球表面软化,并使聚合单体与引发剂随着乙醇溶剂缓慢附着、沉积、浸入微球表层。这样,当温度升高之后,丙烯酰胺聚合反应就可以在荧光素微球表面进行,这也正是形成壳所需要的效果。

4 结 论

本研究以乳液聚合得到的苯乙烯荧光素微球为核,以丙烯酰胺、丙烯酸为壳结构的聚合单体,对加料方式、引发剂选择、交联剂使用、pH调节、浓度配比和溶胀处理等反应条件对形成壳结构的效果以及形态学上的影响进行了研究。得到的最佳反应条件为：在不使用交联剂的前提下以偶氮二异丁腈为引发剂,经过 40 h的乙醇溶胀处理,70℃下反应 3 h,反应过程中保持 pH值在 6～7之间。本研究最终制得的聚苯乙烯核-聚 (丙烯酰胺-丙烯酸)壳荧光素微球具有良好的荧光性能和明显的核壳结构,分散性和稳定性良好,粒径均一且分布范围为 7～8μm。该荧光微球载药量和包封率也相对稳定,分别为 25.14%和 90.21%;并具有良好的缓释性能,其荧光释放率 40 h后稳定在 30%左右。这种核壳结构的荧光素微球有望在免疫检测、蛋白标记等方面得到广泛应用。

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Preparation method of polystyrene core-poly(acrylam ide-acrylic acid)shell fluorescent microspheres

YAOWan-xia1,2,YANGBiao3,L IQun3,SUN Yao-jie3
(1.The First Affliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710061,China;2.School of Life Sciences and Technology,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710049,China;3.School of Information Science and Engineering,Fudan University,Shanghai 200433,China)

Objective：To investigate the p reparation method of polystyrene core-poly(acrylamide acrylic acid)shell fluorescent microspheres.Methods：The polystyrene core-poly(acrylamide-acrylic acid)shell(P-(St-co-AAM))fluorescent microspheres were prepared using fluorescent microspheres as the core and acrylamide/acrylic aspolymerization monomer.Reaction conditions affecting themorphology of core-shell structure including feedingmode,initiator,cross linker,pH,concentration and swelling were studied. Results：Fluorescent microscopy showed that the relatively uniform particle sizes weredistributed in a range of 7-8μm.Fourier transform infra-red spectroscopy(FT-IR)p roved the existence of poly(acrylamide-acrylic acid)shell and amide group on the surface.The optimal conditions for seeding polymerization：azobisisobutyronitrile was used as the initiator in the absence of cross linker,after a 40 h swelling treatment by using alcohol with the appropriate reaction temperature(70℃),reaction time(3 h)and pH(6-7). The average dispersion and stability were 25.14% and 90.21%,respectively.The fluorescein release percentage was kept stable at approximately 30% after 40 h.Conclusion：The fluorescent microspheres prepared by this method have core-shell structure and satisfactory fluorescence properties with good dispersion and stability.

Microspheres; Fluoresceins;Acrylamide/chem; Polystyrenes/chem; Polymers;Emulsions;Technology,pharmaceutical

TQ 460.6

A

1008-9292(2011)01-0044-07

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2011.01.009

2010-08-10

2010-11-24

西安交通大学第一医院院基金(2006YK.25,2007YK.50)资助.

姚晚侠 (1962-),女,博士研究生,康复医学;E-mail：yaowanxia@163.com

孙耀杰 (1969-),男,副教授,主要从事光电测试与控制技术研究;E-mail：yjsun@163.com

[责任编辑 黄晓花 ]