一种制备无菌松材线虫的方法1)

朱丽华 季锦衣 吴小芹 王张丽 叶建仁

(南京林业大学，南京，210037)

一种制备无菌松材线虫的方法1)

朱丽华 季锦衣 吴小芹 王张丽 叶建仁

(南京林业大学，南京，210037)

报道了一种通过用H2O2处理松材线虫卵进而获得无菌松材线虫的方法。实验结果表明，15％H2O2处理对松材线虫卵有一定影响，随着处理时间延长，松材线虫孵化率下降，处理30min以上使其孵化率降低至10％以下;15％H2O2处理时间对获得无菌松材线虫有较大影响，其中，处理60min后获得无菌线虫的机率达70％。在无菌条件下，用无菌松材线虫对赤松无菌组织培养幼苗进行接种能使其发生萎蔫，表明采用该方法制备无菌松材线虫并未使其失去致病性，是一种成功的方法。

松材线虫;H2O2;无菌;致病性

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害，对日本、韩国和中国等多个国家的松林及森林生态系统造成极大的危害并导致巨大的经济损失。长期以来松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner＆Burher)Nickle]被认为是该病的惟一病原[1-3]。Oku等[4]曾提出感病松树的快速萎蔫可能与松材线虫携带的细菌有关，以后又有一些研究者相继报道松材线虫体表携带有各种细菌[5-9]。有关细菌在松材线虫致病过程中的作用引起了国内外学者的关注。Kawazu等经过研究提出松材线虫病的真正病原是松材线虫携带的致病细菌[10-11];洪英娣等和Han等报道松苗萎蔫与线虫种类无关，而是由伴随细菌的种类决定[12-13];赵博光等提出该病是松材线虫和其携带致病细菌的复合侵染病害[14];谈家金等则提出松材线虫及其伴生细菌均是该病不可缺少的致病因素[15]。由上分析可见，松材线虫病的病原及其致病机理至今尚未完全弄清。

由于松材线虫体表携带有多种细菌，为了准确研究松材线虫及其携带细菌与寄主松树间，以及松材线虫与其携带细菌之间复杂的关系，对供试松材线虫有着更高的要求，即需要使用不携带细菌的无菌松材线虫。目前，已有不少关于松材线虫无菌化方法的报道[7，10，16-17]，但这些方法通常需几种试剂进行反复处理，步骤比较复杂。本研究旨在建立一种简便的培养无菌线虫的方法，并对无菌松材线虫的致病性进行了测定。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试松材线虫:试验用松材线虫虫株为AMA3 C1、AMA3 D1及日本虫株宫崎2，其中，AMA3 C1、AMA3 D1为采用全同胞兄妹交配的方式连续培养20代建立的近交系[18]，其亲本为强毒松材线虫虫株AMA3。使用前均培养于灰葡萄孢(Botrytis cinerea)上。

供试松苗:赤松无性系10-4瓶内组织培养幼苗，使用前于DCR活性炭培养基中培养3个月。

试剂:15％H2O2，使用前配制。

1.2 方法

1.2.1 松材线虫卵的收集

将松材线虫培养于灰葡萄孢上5～7d，采用贝尔曼漏斗法分离线虫并收集于无菌的离心管中，离心，去上清;再用无菌水清洗，离心，重复3～5次，最终保留2～3mL线虫悬浮液。将线虫悬浮液置于无菌的盖玻片及小培养皿(直径2.5～3.0cm)中，于25℃下产卵。4～6h后，将线虫彻底清洗干净，获得纯净的松材线虫卵，备用。

1.2.2 H2O2对松材线虫卵孵化的影响

于无菌条件下将载有松材线虫卵的凹玻片置于15％H2O2中浸泡，分别于10～60min后取出，用无菌水清洗3次;于凹槽中加入少量无菌水后置于无菌的大培养皿中，25℃下培养。24h后，于显微镜下检查卵的孵化情况，未经15％H2O2处理的为对照。重复3次以上。

1.2.3 无菌松材线虫的培养及检验

将载有松材线虫卵的小培养皿置于无菌的大培养皿中，加入新配制的15％H2O2将其淹没，分别于浸泡10～60min后取出，用无菌水清洗3次后，加入少量无菌水将卵淹没，将其置于无菌的大培养皿中，于25℃下培养，30h后于无菌条件下用移液器将小培养皿中孵化的线虫转入灰葡萄中皿。未经15％H2O2处理的为对照。

待线虫将灰葡萄孢吃尽，于无菌条件下用灭菌的漏斗、止水夹、面巾纸将线虫收集于无菌的离心管中，离心，保留2～3mL。取1mL线虫液至研钵中，加石英砂研磨后涂布营养琼脂培养基(NA)平板，或取200μL线虫液与熔化至50℃左右的NA培养基混合倒平板。平板置于30℃恒温箱中倒置培养，3d后观察NA平板的染菌情况，统计染菌率。每处理重复3次以上。

1.2.4 无菌松材线虫的致病力测定

于无菌条件下将组培苗取出，切去顶梢后，接种于新鲜的DCR活性炭培养基中，将无菌棉球置于伤口处，用微量进样器注入无菌或带菌松材线虫悬液20μL，约含线虫200条，无菌水为对照。30℃下培养，逐日观察发病情况，统计感病率。每处理接种18～22株苗，重复2次。

1.2.5 接种松材线虫的再分离及无菌线虫的再检验

接种20d后，将感病植株取出，用剪刀将其针叶和茎段剪成2～4mm长短的小段，用贝尔曼漏斗进行线虫的再分离，24h后对其数量进行统计。其中，无菌线虫接种的植株在无菌条件下进行线虫的再分离。采用两种方法对接种后的无菌松材线虫的无菌情况进行再检验，即取无菌条件下分离出的线虫悬液200μL与熔化至50℃左右的NA培养基混合倒平板，或直接将植株剪碎于NA平板上，并滴加1mL无菌水。培养条件同前。

2 结果与分析

2.1 H2O2对松材线虫卵的影响

显微镜镜检发现，H2O2处理对松材线虫卵有较大影响。未经H2O2处理的松材线虫卵大部分能正常发育;15％H2O2处理可抑制卵的发育，致使其停留于某一发育阶段或导致畸形胎形成，使其不能正常孵化，甚至卵壳破损，卵内物质泄漏出外。孵化率检查结果表明，随着H2O2处理时间的延长，松材线虫卵的孵化率逐渐下降。15％H2O2处理10min，卵孵化率降低至35.3％，当处理时间超过30min后，孵化率降至10％以下，与对照相比差异显著(表1)。

2.2 H2O2处理时间对松材线虫无菌化的影响

实验对松材线虫近交系AMA3 C1和AMA3 D1及日本虫株宫崎2的卵进行了无菌化处理。NA培养基检验结果表明，15％H2O2处理时间对无菌松材线虫的获得至关重要。15％H2O2处理时间短于50min，未能彻底杀死松材线虫卵表面的细菌，3个虫株所孵化的线虫均100％带菌。处理50min的9个重复中，4个完全无菌，无菌率为44.4％;处理60min的10个重复中，7个完全无菌，无菌率达70％(表2)。由于15％H2O2处理时间过长会影响卵的孵化，因此，15％H2O2处理时间应控制在60min左右。

在NA培养基上，未经H2O2处理或处理不彻底的松材线虫卵所培育的线虫留下大量细菌菌落(图1a，b)，而无菌线虫研磨液涂布的NA培养基上无任何细菌菌落，无菌线虫与NA培养基混合的平板上留下无数清晰的线虫爬行轨迹(图1c，d)。

表1 15％H2O2处理对松材线虫卵孵化的影响

表2 15％H2O2处理时间对松材线虫无菌化的影响

图1 松材线虫在NA培养基上留下的轨迹

2.3 无菌松材线虫的致病力

于无菌条件下用本研究获得的无菌松材线虫和普通带菌松材线虫对无菌赤松组培苗进行接种，均能使其发病。赤松组培苗接种线虫后，最早于第5天表现出感病症状。无菌松材线虫和带菌松材线虫所致萎蔫症状表现一致，均为针叶先褪色、黄化，进而枯萎变成红褐色。再分离结果表明，用无菌松材线虫和带菌松材线虫接种无菌组培苗后，在发生萎蔫的组培苗体内均能再分离出松材线虫。

2.4 接种无菌松材线虫致萎植株上再分离线虫的无菌再检验

取再分离自无菌松材线虫接种致萎赤松组培苗的19个线虫样以及10株赤松组培苗剪碎后在NA平板上于30℃下培养3d以上。结果表明，用无菌松材线虫对赤松组培苗进行接种未感染上任何细菌。

3 结论与讨论

本研究建立了一种通过消毒松材线虫卵从而获得无菌线虫的培养方法。

根据已有的知识，植物寄生线虫的口针比较小，所以体内没有细菌[19]。利用透射电镜对松材线虫各部分进行详细观察，未在线虫体内的任何部位观察到细菌[6]。因此，很多无菌化的方法是采用对松材线虫直接进行表面消毒以获得无菌线虫[7，13-17，20]。由于松材线虫体表存在大量细菌，因此难以彻底灭菌，要达到完全无菌，步骤通常比较繁琐，如贲爱玲等报道用H2O2和抗菌素交替并反复处理松材线虫才能获得无菌松材线虫，即用5％H2O2浸泡5min，无菌水离心换洗3次，加入抗菌素混合液(青霉素、链霉素、庆大霉素液)浸泡60min，离心洗涤，再用抗菌素混合液浸泡60min，重复3次，最终无菌率达 18％[17]。

Iwahori等曾报道用0.5％硫柳汞和0.5％链霉素混合液处理松材线虫卵20min获得无菌线虫的方法[21]。Kawazu等参照Iwahori等的方法进行无菌线虫的制备，发现用0.5％硫柳汞和0.5％链霉素处理松材线虫卵20min所培养出的线虫并非完全无菌，随后用0.5％硫柳汞、0.1％链霉素分别再处理15、30min，3次处理后的线虫未能达到完全无菌，又用0.5％链霉素处理15min，最终获得无菌线虫[10]。本研究采用15％H2O2对松材线虫卵进行浸泡60min，获得了比较好的效果，无菌线虫获得率达70％。由于用15％H2O2处理时间过长会对松材线虫卵的孵化率造成一定影响，故15％H2O2处理时间并非越长越好，而应控制在一定的范围内。

与以往一些报道[10，12，14-15]相比，采用 H2O2消毒松材线虫卵所获得的无菌松材线虫依然能使无菌赤松组培苗发病，表明采用该方法对松材线虫进行无菌化处理并未使其失去致病性。其间的差异是否与进行无菌化所采用的方法和试剂不同有关尚待进一步研究。

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A Method for Obtaining Aseptic Pine Wood Nematode

/Zhu Lihua，Ji Jinyi，Wu Xiaoqin，Wang Zhangli，Ye Jianren(College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，P.R.China)//Journal of Northeast Forestry University.-2011，39(6).-65～67，71

Bursaphelenchus xylophilus;Hydrogen peroxide;Asepticism;Pathogenicity

S763

1)国家重点基础研究发展计划(2009CB119200)，江苏省博士后基金(0802048C)，江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室开放基金项目(PMIS200802)。

朱丽华，女，1970年10月生，南京林业大学森林资源与环境学院，讲师。

叶建仁，南京林业大学森林资源与环境学院，教授。E- mail:jrye@njfu.com.cn。

2011年1月7日。

责任编辑:戴芳天。

This paper describes a method for obtaining aseptic pine wood nematode(Bursaphelenchus xylophilus)by egg disinfection.Results showed that 15 percent hydrogen peroxide had a profound effect on egg hatching of pine wood nematode.The hatching rate of the pine wood nematode decreased with the prolonged processing time，and it decreased to less than 10 percent by soaking the eggs in 15 percent hydrogen peroxide for more than 30min.The obtained aseptic pine wood nematode was obviously influenced by egg processing time in 15 percent hydrogen peroxide，and the probability of obtaining aseptic pine wood nematode was up to 70 percent after processing for 60min.The microcuttings of Pinus densiflora were inoculated with aseptic pine wood nematode under aseptic conditions，which resulted in the wilt of microcuttings.It showed that the asepsis did not cause the pine wood nematode to lose its pathogenicity.