南美白对虾虾头主要自溶酶的分离纯化及鉴定

银凤,周爱梅,张祥刚,曹庸,刘欣,陈永泉

南美白对虾又称凡纳对虾,是世界上养殖产量最高的三大优质虾种之一,也是目前世界上三大养殖对虾单产量最高的虾种。南美白对虾壳薄体肥,肉质鲜美,含肉率高,是一种高蛋白、高钙、低脂肪的食物。

南美白对虾在储藏过程中,常常发生发臭等腐败现象,除了微生物的作用外,虾头中的内源酶在虾的自溶过程中起到重要作用。据报道,南美白对虾虾头中内源酶种类复杂,含量丰富,且活性很高[1-2]。这些内源酶在虾存活时起消化作用,死亡后又起到了降解蛋白质的作用,目前对于南美白对虾虾头中的内源酶的研究报道较少[3-4],哪类酶或哪种酶在虾的腐败、蛋白质分解中起主要作用的研究尚未见报道。为此,本实验以内源酶水解实验为检测指标,通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析、DEAE-DE52阴离子交换层析等方法分离纯化南美白对虾虾头中的主要自溶酶,并通过抑制剂试验及 SDS-PAGE对纯化酶进行鉴定,从而合理解释虾的自溶现象,为南美白对虾的贮藏控制及虾的自溶水解提供科学指导和理论依据,同时也为虾头废弃物的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及仪器

南美白对虾虾头、虾壳,由阳江市谊林海达速冻水产有限公司提供,-18℃冷冻备用。

胰蛋白酶标准品、苯甲基磺酰氟 (PMSF)、胃酶抑素 A(Pepstatin A),Sigma公司;碘乙酸,上海伯奥生物科技有限公司;乙二胺四乙酸 (EDTA),天津市科密欧化学试剂发展中心;Sephadex G-100,瑞典Pharmacia公司;DEAE-DE52,英国 Whatman公司;其余试剂均为市售生化或分析纯试剂。

752型紫外可见分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;层析柱 (1.6×40 cm),上海嘉鹏科技有限公司;TH-1000A梯度混合器、HD-21-Z紫外检测仪,上海青浦沪西仪器厂;JM-250电泳仪,大连捷迈科贸有限公司;DYZ-28A型电泳槽,北京六一仪器厂;B I O-BEST140M凝胶成像系统,西盟国际公司中国(总部 )。

1.2 试验方法

1.2.1 南美白对虾虾头粗酶液的制备

以自来水解冻虾头,然后加入一定量的 pH 7.0磷酸盐缓冲液,经组织捣碎机捣碎,加入 pH 7.0磷酸盐缓冲液得到料液比 1∶3(g∶mL)的组织液,在 20℃抽提虾头 6 h,10 000 r/min离心 20 min,取上清液即为粗酶液。

1.2.2 硫酸铵分级沉淀

按饱和度 25%、35%、45%、55%、65%、75%在4℃逐步进行硫酸铵分级沉淀,盐析过夜,然后 12 000 r/min冷冻离心 20 min。将所得沉淀用一定体积的预冷超纯水溶解,测定蛋白质含量和酶活力。

1.2.3 Sephadex G-100凝胶层析

将经硫酸铵沉淀、透析除盐、真空冷冻干燥浓缩后的样品用一定体积超纯水溶解,12 000 r/min冷冻离心 20 min,取上清液上样 (1.6×40 cm,其中平衡缓冲液为 pH值 7.0、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液),以 pH值 7.0的低离子浓度 (0.01 mol/L)磷酸盐缓冲液和pH值 7.0的高离子浓度磷酸盐缓冲液 (0.1 mol/L,含 0.2 mol/L NaCl)各 100 mL为洗脱液进行梯度洗脱,流速为 30 mL/h,每 6 min收集 1管,分别测定每管收集液的蛋白质含量与酶活力。

1.2.4 DEAE-DE52阴离子交换柱层析

将上述凝胶层析收集的样品冷冻干燥浓缩,用一定量超纯水溶解,12 000 r/min冷冻离心 20 min,取上清液上样 (1.6×40 cm,其中平衡缓冲液为 pH值7.0、0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液 ),以 pH值 7.0低离子浓度 (0.01 mol/L)Tris-HCl缓冲液和 pH值 7.0的高离子浓度 Tris-HCl缓冲液 (0.1 mol/L,含 0.2 mol/L NaCl)各 100 mL为洗脱液进行梯度洗脱,流速为30 mL/h,每 6 min收集 1管,分别测定每管收集液蛋白质含量和酶活力。

1.2.5 内源酶对虾头、虾壳的水解试验

在 pH值 7.0、温度 55℃、料水比 1∶2(g∶mL) 的条件下,通过添加一定量的虾头提取物 (含内源酶)对已高温灭酶的虾头、虾壳进行水解,5 h后采用甲醛滴定法[5]测定氨基酸态氮含量。

1.2.6 抑制剂实验

参考 Klomklao等[6]的方法并略作修改。在酶溶液中加入等体积的蛋白酶抑制剂,使抑制剂在酶溶液中的终浓度分别为:1 mmol/L PMSF、2μmmol/L Pepstatin A、1 mmol/L碘乙酸、2 mmol/L EDTA,室温下静置 1 h后,分别取 1 mL反应液测定酶活力,同时以加入同体积的去离子水代替抑制剂的酶溶液在相同条件下测得的酶活力定义为 100%,计算不同抑制剂的抑制率。

1.2.7 SDS-PAGE

参考 Laemmli[7]的方法进行 SDS-PAGE,分离胶浓度为 12.5%,浓缩胶浓度为 4.5%。10μL酶样品或标准蛋白与 10μL上样缓冲液充分混合后,水浴100℃处理 3 min,冷却后上样。起始电流为 15 mA,待溴酚蓝前沿进入分离胶后将电流调为 30 mA,当溴酚蓝前沿跑至距胶底部 0.5 cm时终止电泳,取下凝胶用考马斯亮蓝染色法进行染色。

1.2.8 蛋白质含量、内源酶酶活力测定

蛋白质含量测定参见考马斯亮蓝法[8];内源酶酶活力采用紫外检测法[9],以酪蛋白为底物。

2 结果与分析

2.1 硫酸铵分级沉淀

采用不同饱和度的硫酸铵对粗酶液中的南美白对虾虾头主要自溶酶进行纯化,测定沉淀中的蛋白质含量及蛋白酶活力,结果如图1所示。当硫酸铵浓度为 20%～30%时,沉淀中的蛋白酶活力与初始值基本保持不变,且酶活力较低,表明这一阶段沉淀的蛋白为杂蛋白;随硫酸铵浓度由 30%增加到 70%,沉淀中的蛋白质含量与蛋白酶活力不断增加,其中酶活力较硫酸铵饱和度为 30%时提高 7倍多,说明此阶段沉淀的蛋白主要为目的蛋白;当饱和度大于 70%后,蛋白质含量虽然增加,酶活力却略有下降,表明大部分的蛋白酶已被沉淀下来。因此,为了较好地达到去除杂蛋白的目的,实验选取的硫酸铵饱和度为 30%～70%。

图1 硫酸铵饱和度对南美白对虾虾头蛋白质含量及蛋白酶活力的影响

2.2 Sephadex G-100凝胶层析

盐析处理后的酶液经透析除盐、冷冻干燥后,进行 Sephadex G-100凝胶层析,以管号为横坐标,以蛋白质含量及酶活力为纵坐标绘制洗脱曲线,结果如图2所示。蛋白质洗脱曲线主要分为 2个峰,其中第 1个峰出现在第 5～9管,此时蛋白质含量很高;第 2个峰出现在第 22～32管之间,该峰出峰时间间隔较长,含量较第 1个物质略低;而主要酶活力峰出现在这 2个蛋白峰之间,根据酶活力曲线与蛋白质含量曲线,把收集到的成分分成 6个部分,分别为 1～4、5～6、7～9、10～19、20～28、29～40六个组分。

图2 Sephadex G-100凝胶层析洗脱曲线

对 6个组分进行冷冻干燥浓缩,并以相同质量蛋白加入到已灭酶的虾头虾壳中,进行水解试验,结果如图3所示。水解实验表明,组分Ⅳ的氨基酸态氮含量最高,水解作用最明显,说明起水解作用的主要内源酶集中在该组分,收集该组分进一步分离纯化同时取样进行 SDS-PAGE。

图3 Sephadex G-100凝胶层析收集组分水解试验

2.3 DEAE-DE52阴离子交换柱层析

为了制得纯度更高的自溶酶,对组分Ⅳ进行 DEAE-DE52阴离子交换柱层析 (图4)。洗脱曲线主要分为 2个组分峰,其中组分峰Ⅰ洗脱液具有较高蛋白质含量,但酶活力却较低;组分峰Ⅱ酶活力为第一组分峰的 4倍左右,收集 2个组分峰的成分,冷冻干燥浓缩后进行水解实验,结果见图5。图5结果显示,组分Ⅱ的水解液中氨基酸态氮含量较高,水解作用最明显。因此,收集该组分进行抑制剂实验及 SDS-PAGE。

图4 DEAE-DE52阴离子交换柱层析洗脱曲线

图5 DEAE-DE52阴离子交换柱层析收集组分水解试验

2.4 主要自溶酶的分离纯化结果

分别对每步收集的酶液测定酶活力与蛋白质含量,计算比活力与纯化倍数,结果见表1。纯化处理后的蛋白酶比活力高达 2.2×106U/g,纯化倍数为96.90。

表1 各处理蛋白酶比活力及纯化倍数对比

2.5 主要自溶酶的鉴定

2.5.1 纯化后主要自溶酶的抑制剂试验

对DEAE-DE52阴离子交换柱层析后收集的组进行抑制剂实验,结果如图6所示。所选用抑制剂中,P MSF是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂[10],Pepstatin A是天冬氨酸蛋白酶特异性抑制剂[6],EDTA为金属蛋白酶特异性抑制剂[11],碘乙酸是半胱氨酸蛋白酶的特异性抑制剂[6]。结果显示,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该组分抑制效果最为明显,抑制率高达91.3%,而其它抑制剂对其抑制效果不明显,说明该组分纯度较高且以丝氨酸蛋白酶为主要酶类。

图6 纯化后组分Ⅱ的抑制剂试验

2.5.2 SDS-PAGE

对DEAE-DE52阴离子交换柱层析后组分Ⅱ进行 SDS-PAGE,结果如图7所示。经 DEAE-DE52阴离子交换柱层析后组分Ⅱ的 SDS-PAGE显示,电泳图只显示出一条泳带,且该带与标准胰蛋白酶在电泳中移动距离相同,表明南美白对虾虾头主要自溶酶为胰蛋白酶。

3 结论

南美白对虾虾头粗酶液经 30%～70%饱和硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析、DEAE-DE52阴离子交换柱层析处理后,蛋白酶比活力为 2.2×106U/g,纯化倍数达到 96.90。抑制剂实验、SDS-PAGE与Native-PAGE结果表明,南美白对虾虾头中的主要自溶酶为胰蛋白酶。

图7 组分ⅡSDS-PAGE(注:“ck”为标准胰蛋白酶,“样”代表组分Ⅱ)

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