多菌种发酵丹贝的制作工艺与营养成分分析

刘全德,刘恩岐,贺菊萍,张建萍

(徐州工程学院江苏省食品生物加工工程技术研究中心,江苏徐州,221008)

多菌种发酵丹贝的制作工艺与营养成分分析

刘全德,刘恩岐,贺菊萍,张建萍

(徐州工程学院江苏省食品生物加工工程技术研究中心,江苏徐州,221008)

以氨基氮含量为主要评价指标,结合感官评分,确定了多菌种发酵制作丹贝的前发酵工艺条件:在蒸煮大豆基质中加入 3%的米粉,接种 3%的乳酸菌,于 42℃发酵 2.5 h至 pH值 5.0,再加入 5%的少孢根霉∶甜酒曲为 3∶2的混合菌,于 37℃下发酵 18 h。将经过前发酵的大豆在盐水中进行后发酵处理,结果表明,在质量分数为5%的盐水中于 20℃后发酵 9 d,或在质量分数为 2%的盐水中于 4℃后发酵 15 d,氨基氮含量等营养成分趋于平衡,发酵丹贝产品的营养和风味明显改善,通过冻干或油炸等处理,适用于休闲食品、发酵调味料或餐桌菜肴等的开发生产。

大豆,丹贝,少孢根霉,甜酒曲,营养成分

丹贝也叫天培,起源于印度尼西亚,是有益健康的大豆发酵食品[1]。丹贝的制作有天然发酵和纯种发酵 2种方法,天然发酵不易控制,易滋生杂菌腐败[2];纯种发酵目前主要以少孢根霉作为丹贝生产的菌种,并添加乳酸酸化,使 pH降低抑制杂菌生长[3-4]。纯种发酵丹贝的质量不及天然发酵制品,生产营养和风味较好的丹贝产品不是某一株优良菌种所能提供的,必须有多种微生物的协同作用[5]。吴大康利用我国传统的甜酒曲制作丹贝的研究表明[6],甜酒曲中的优势生长菌为米根霉,可以作为丹贝生产的良好菌源。本研究在煮熟大豆中先接种乳酸菌,利用生物发酵产生的乳酸降低大豆基质的 pH值,再同时接种一定比例的少孢根霉和甜酒曲,采用多菌种混合发酵的方法生产营养和风味俱佳的丹贝产品,在发酵工艺条件优化的基础上[7],通过多菌种发酵与少孢根霉纯种发酵丹贝产品营养成分的比较,研究分析了多菌种混合发酵过程中的营养成分变化,旨在为丹贝产品的工艺改进提供理论技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与菌种

大豆,市售;少孢根霉 (Rhizopus oligosporu)和保加利亚乳酸杆菌 (Lactobacillusbulgaricus),中国科学院微生物研究所菌种保藏中心;甜酒曲,江西润源生物科技公司;培养基,马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA);乙醚 (AR)、乙醇 (AR)、醋酸 (AR),国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

pHS-3C精密 pH计,上海世义精密仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器、电热恒温培养箱,上海跃进医疗器械厂;TU-1810紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;LGJ-18A型冷冻干燥机,北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 丹贝发酵制作工艺

1.2.1.1 发酵菌种的制备

少孢根霉孢子粉的制备[8]:将少孢根霉菌种接种到 PDA培养基上,37℃恒温培养 24 h,至表面长满白色孢子为止。用无菌水制成孢子悬浮液,然后和灭菌米粉混合,冷冻干燥,制成少孢根霉孢子粉,装入无菌平皿中,在 0～4℃保存备用。

乳酸菌的制备:将已活化的菌种以 3%接菌量接入经 115℃、0.1 MPa灭菌的牛奶培养基中,于 42℃恒温培养至乳凝固,放入 0～4℃冰箱中备用。

甜酒曲的使用:将商品甜酒曲保存在 0～4℃冰箱中,直接接种使用。

1.2.1.2 单菌种发酵试验

大豆浸泡去皮后常压蒸煮 30 min,摊放在清洁的白磁盘上,冷却至 30℃左右,用乳酸调节 pH值,在大豆基质中分别接入不同比例的少孢根霉孢子粉、乳酸菌或甜酒曲,覆盖一层保鲜膜,分别于 27～47℃不同温度条件下发酵 6～18 h,根据发酵产品中的氨基氮含量,结合感官评价确定少孢根霉、乳酸菌和甜酒曲发酵的最适温度、最适 pH值、最佳接种量和最佳发酵时间。在试验得出的最适发酵条件下,分析比较少孢根霉、乳酸菌和甜酒曲对蒸煮大豆的发酵作用。

1.2.1.3 多菌种发酵试验

前酵工艺的确定:将乳酸菌接种于蒸煮大豆中,将大豆基质的 pH降至少孢根霉和甜酒曲发酵的最适条件;再将少孢根霉和甜酒曲按不同的比例,接种于大豆基质中进行多菌种混合发酵,以发酵大豆的氨基氮含量为评价指标,结合感官评定分析确定少孢根霉与甜酒曲的最佳混合比例;采用正交试验设计进一步确定少孢根霉与甜酒曲混合发酵的接种量、发酵时间和发酵温度等前酵最佳工艺条件。

后酵工艺的确定:将前发酵后的大豆按大豆基质的质量:盐水量为 1∶1.5分别浸入质量分数为 1%、2%和 3%的 4℃盐水中,或质量分数为 2%、5%和8%的 20℃盐水中,进行发酵成熟,每隔 3天测一次氨基氮含量等,结合感官评定综合分析确定后酵工艺条件。

1.2.1.4 丹贝发酵产品感官评价

以 10人组成感官评定小组,按色泽、外形、组织状态和风味等指标评分,具体项目和评分标准见表1。

表1 丹贝发酵产品感官评价标准

1.2.2 丹贝发酵产品营养成分的测定

1.2.2.1 含氮营养成分的测定[8-9]

总氮量的测定:将丹贝发酵样品冻干磨碎后,以凯氏定氮法测定总氮。

酸溶性氮 (游离氨基酸及肽类物质)含量的测定:将丹贝样品冻干磨碎,以质量分数为 10%的醋酸水溶液浸泡,沸水浴 1 0 min提取含氮物,4 000 r/min离心 3 0 min,取上清液;余下的沉淀再重复提取 2 次,合并上清液,以凯氏定氮法测定酸溶性氮。

氨基酸态氮含量的测定:甲醛滴定法。

多肽氮的推算:多肽氮 =酸溶性氮 -氨基酸态氮

水溶性氮的测定:以蒸馏水代替 1 0%醋酸 2 0℃浸泡样品 1 0 min,其余步骤同酸溶性氮含量的测定。

醇溶性氮含量的测定:以 70%乙醇代替 10%醋酸浸泡样品,提取条件为 6 0℃水浴 1 0 min,其余步骤同酸溶性氮含量的测定。

1.2.2.2 脂类营养成分的测定[10-11]

脂类总量的测定:索氏抽提法。

碘价的测定:取索氏抽提所得脂肪测定碘价。

1.2.2.3 还原糖含量的测定

称取冷冻干燥样品 1.0 g于 100 mL容量瓶中,加水 8 0 mL,在 4 5℃水浴中加热 1 h,并持续振荡。冷却后定容,混匀。放置 3 0 min,离心后取上清液,采用亚铁氰化钾法测定还原糖含量[10]。

1.2.2.4 总酸含量的测定

称取 1 0 g冻干磨碎样品,加 60 mL水于沸水浴中保温搅拌 1 h,再转移到 100 mL容量瓶中定容,3 500 r/min离心 2 0 min,取 10.0 mL上清液用 0.1 mol/L NaOH滴定[10]。

2 结果与分析

2.1 丹贝发酵制作工艺试验结果分析

2.1.1 单菌种发酵制作丹贝试验结果

少孢根霉、乳酸菌和甜酒曲的最适发酵条件与丹贝发酵试验结果见表 2。经少孢根霉发酵的大豆氨基氮含量较高,甜酒曲次之,且发酵豆瓣表面均能形成致密的白色菌丝、感官评分良好,说明少孢根霉和甜酒曲具有较强的蛋白水解酶系,均可单独作为丹贝制作的发酵菌种。而乳酸菌仅有轻微的蛋白水解能力,不能单独作为丹贝制作的发酵菌种。

表2 单菌种发酵制作丹贝试验结果比较

2.1.2 多菌种最佳发酵条件的确定与丹贝发酵试验结果

2.1.2.1 乳酸菌发酵时间的确定

本试验将乳酸菌作为生物降酸的菌种,当接种3%乳酸菌发酵至 2.5 h时,大豆蒸煮基质的 pH由pH值 6.3降至 pH值 5.0,为少孢根霉和甜酒曲的适宜 pH,因此确定乳酸菌发酵时间为 2.5 h。

2.1.2.2 少孢根霉和甜酒曲混合发酵接种比例的确定

大豆基质经乳酸菌发酵降酸后,加入少孢根霉和甜酒曲混合发酵 18 h制作丹贝产品,少孢根霉和甜酒曲接种比例的试验结果如表 3。当少孢根霉和甜酒曲按 3∶2接种时,氨基氮含量、NSI和感官评分最高,而接种比例增加为 4∶1时,大豆表面菌丝有部分变黑,感官欠佳,因此确定少孢根霉和甜酒曲按 3∶2接种。

表3 少孢根霉和甜酒曲混合发酵接种比例的试验结果

2.1.2.3 多菌种发酵制作丹贝前酵工艺条件试验结果

选择混合菌 (少孢根霉∶甜酒曲为 3∶2)接种量、发酵温度、发酵时间和米粉添加量为影响因素,选用L9(34)正交表进行试验,试验结果见表 4。

表4 多菌种发酵制作丹贝正交试验结果

由表 4极差分析可知,各因素对丹贝氨基氮含量的影响次序为:A>B>C>D,即接种量 >发酵温度 >发酵时间 >米粉添加量,丹贝前酵最佳工艺条件为A2B2C2D3。对理论分析最佳发酵工艺条件做验证试验,结果表明,在该工艺条件下发酵大豆氨基氮含量为 0.35%,高于试验最佳组合 5发酵大豆 0.32%的氨基氮含量,且产品质地风味俱佳,感官评分值达95分。据此确定了多菌种发酵制作丹贝前酵最佳工艺条件:在蒸煮大豆基质中加入 3%的米粉,米粉的作用主要是吸收豆瓣表面过多的水分,并可作为微生物生长的碳源,先接种 3%的乳酸菌,于 42℃恒温发酵 2.5 h至 pH5.0,然后接种 5%的少孢根霉和甜酒曲混合菌 (少孢根霉∶甜酒曲为 3∶2),在 37℃恒温下发酵 18 h。

2.1.2.4 多菌种发酵制作丹贝后酵工艺条件试验结果

将前发酵后的大豆按大豆基质总质量∶盐水量为1∶1.5进行后发酵处理,利用前酵过程中积累的蛋白酶和脂肪酶继续分解大豆蛋白与脂肪,增进发酵大豆的营养价值与风味。结果表明,在质量分数为 5%的盐水中于 20℃后发酵 9 d或在质量分数为 2%的盐水中于 4℃后发酵 15 d,氨基氮含量及 NSI等指标趋于平衡,发酵制品的营养和风味明显提高。

2.2 丹贝发酵产品营养成分测定结果分析

2.2.1 含氮营养成分的测定结果比较

不同发酵处理丹贝产品氮素营养成分的比较见表 5。前酵豆与蒸煮豆的总氮含量无明显变化,后酵豆总氮明显减少,可能是氨态氮经过硝化细菌的氧化作用,导致系统内氨减少所致[12]。多菌种前酵豆酸溶性氮(游离氨基酸及肽类物质)、氨基氮等的含量均明显高于少孢根霉单菌种发酵豆,表明多菌种发酵的蛋白酶系种类较多,可以弥补少孢根霉单菌发酵酶系单一之不足,多菌种混合发酵较单一菌种发酵丹贝产品的营养价值高。后酵豆的酸溶性氮、氨基氮等的含量均显著高于多菌种前酵豆,表明后酵过程利用前酵中积累的蛋白酶继续分解大豆蛋白,是丹贝营养及风味物质形成的重要时期。

表5 不同发酵处理丹贝产品氮素营养成分的比较

2.2.2 脂类营养成分的测定结果比较

不同发酵处理丹贝产品脂类营养成分的比较见表 6。前酵豆和后酵豆的总脂含量与蒸煮豆对照相比均有所降低,可能是脂肪被作为菌种生长所需的碳源所致[12]。多菌种前酵过程中不仅少孢根霉有分解脂肪的能力,而且甜酒曲中的丝孢酵母和米曲霉也有分解脂肪的能力,多菌种前酵豆比少孢根霉发酵豆的总脂含量的降低程度大。碘价体现了脂肪的不饱和程度,少孢根霉发酵豆、多菌种前酵和后酵豆的碘价依次升高,表明丹贝产品中脂肪的不饱和程度在脂肪酶的作用下不断提高,不饱和脂肪酸具有降低胆固醇、防止动脉硬化等生理功能,意味着其保健作用随之加强。

表6 不同发酵处理丹贝产品脂类营养成分的比较

2.2.3 还原糖与总酸含量的测定结果比较

不同发酵处理丹贝产品的还原糖与总酸含量比较见表 7。少孢根霉发酵豆还原糖含量增加不明显,多菌种前酵豆的还原糖含量与蒸煮豆对照相比显著增加,这是因为少孢根霉不能利用淀粉,对水苏糖、棉子糖、蔗糖的利用率也很差,因此生成的还原糖较少,而多菌种发酵甜酒曲中的米根霉可使淀粉转化为葡萄糖,还原糖含量增加较多。后酵豆的还原糖含量显著降低,比蒸煮豆对照还低,这是因为在发酵过程中,微生物会利用分解碳水化合物得到的还原糖满足自身有机体的合成与能量的需要,到发酵后期还原糖生成量远低于还原糖消耗量,因此表现为还原糖含量的减少[12]。

表7 不同发酵处理丹贝产品还原糖和总酸含量的比较

多菌种前酵豆和少孢根霉发酵豆的总酸含量与蒸煮豆对照相比明显增加,说明在发酵过程中微生物分泌大量的淀粉酶和脂肪酶,使大豆中的碳水化合物和脂肪分解成有机酸和脂肪酸,使总酸含量增加。后酵豆中的总酸含量显著高于多菌种前酵豆和少孢根霉发酵豆,表明并印证了后酵是丹贝中总酸及其他风味物质形成的重要时期[12]。

3 结论

试验确定了乳酸菌、少孢根霉和甜酒曲多菌种发酵制作丹贝产品的新工艺,乳酸菌发酵起到了生物降酸作用,为后续少孢根霉和甜酒曲混合菌种发酵创造了适宜 pH条件,且乳酸菌利用可发酵性糖产生乳酸有助于改善产品的风味。多菌种发酵的酶系种类较多,可以弥补少孢根霉单菌发酵酶系单一之不足。多菌种发酵丹贝的酸溶性氮 (游离氨基酸及肽类物质)、氨基氮等含氮营养成分以及不饱和脂肪酸、还原糖与总酸等的含量均高于少孢根霉单菌种发酵产品,多菌种混合发酵丹贝的营养价值和感官品质较少孢根霉单菌纯种发酵明显提高。

在多菌种发酵的基础上探讨了丹贝的后发酵成熟过程,结果表明后发酵过程利用前酵中积累的蛋白酶和脂肪酶继续分解大豆蛋白与脂肪等,是营养物质以及风味物质形成的重要时期。在质量分数为 5%的盐水中于 20℃后酵 9d的产品,具有浓郁的酱香与酯香味,但其含盐量高,可以作为发酵调味料或冻干磨粉后与其他调味品混合制成复合调味剂。在质量分数为 2%的盐水中于 4℃后酵 15d的产品,含盐量较低,风味柔和,经冻干或油炸处理等可以加工为休闲食品或餐桌菜肴。

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Manufacture Technology and Analysis of Nutritional Compositions of Tempe Fermented byM ultiple-stra in Culture

Liu Quan-de,Liu En-qi,He Ju-ping,Zhang Jian-ping
(Jiangsu Engineering Research Center for Food Biology Processing,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221008,China)

This study took the content of amino nitrogen as evaluation indicator,combined sensory scoring,and determined the opti mum technology of primary fermentation following these steps:added 3%rice flour in cooked soybean,inoculated 3%lactic acid bacteria,fer mented for 2.5 hours at 42℃(pH 5.0),then fermented further for 18h at 37℃with additional 5%mix-culture of rhizopus oligosporus and s weetwine koji(ratio of 3∶2).The results showed that the contentsof amino nitrogen were al most the same as the former fermented soybean fermented in 5%saline at 20℃ for9 days,2%saline at4℃ for 15 days afterpost-fer mentationmaturing.Nutritional facts and flavorof tempe were both improved after fer mentation.By freeze-drying or frying,tempe can be developed as snack food,fermented seasoning and table food.

soybean,tempe,rhizopus oligosporu,s weetwine koji,nutrition matter

学士,副教授 (刘恩岐教授为通讯作者)。

2010-10-19,改回日期:2010-12-20