从腐败食品中分离的乳酸菌生物被膜形成的影响因素

谢丽斯,张宏梅,刘学禄,张文艳,黄宝威,许佳晶,郑添信,刘彦兰

乳酸菌 (LAB)作为发酵剂广泛应用于乳制品、肉制品、腌制制品等的食品加工,使这些食品具有各种独特风味。但另一方面,一部分乳酸菌 LAB也可引起食品的腐败变质[1],如蔬菜、肉类食品腐烂变质。而且,引起食品变质的 LAB均能耐受不同的环境选择压力[2]。生物膜是指细菌粘附于物质接触表面,分泌大量胞外多聚糖基质,脂质蛋白等,包裹自身形成的微生物群落[3]。国外已有一些关于某种乳酸菌生物成膜的研究报道,但国内相关研究尚少。本研究是从腐败变质的食品中分离筛选乳酸菌,了解不同培养条件下 LAB生物被膜形成的情况,为 LAB生物成膜引起食品变质提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品材料

自然环境中发酵腐败的蔬菜 3份:豆角、笋、萝卜 ,腌猪肉 1份。

1.1.2 培养基及试剂

改良MRS培养基配方参见文献 [4],革兰氏染色液,95%乙醇,蒸馏水,0.04%溴甲酚绿酒精溶液,1%结晶紫。

1.1.3 实验器材

96孔平底细胞培养板 (655180):德国 Greinerbio-one公司;酶标仪 (Model 68O):BioRad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

参照文献 [5]。

1.2.2 腐败食品中乳酸菌的分离

取发酵腐败蔬菜及腌肉预处理→10倍稀释法→取样品稀释液 250μL涂布于含 0.04%溴甲酚绿的改良MRS固体培养基平板→37℃生化培养箱中培养24 h→挑取出现黄色斑点且有溶钙圈的单菌落→反复在培养基上划线纯化→单菌落菌株→甘油保存菌株于 -20℃。

1.2.3 乳酸菌鉴定

革兰氏染色镜检和接触酶实验按文献[4]的方法,乳酸菌产生乳酸的定性检测采用纸层析法,具体参见文献 [6],以 1.5%的标准乳酸溶液和 1.5%的标准乙酸溶液分别作为阳、阴性对照。

1.2.4 微孔板法测定生物被膜光密度值 (OD值)

将分离筛选出的乳酸菌活化,37℃培养 48h后,取菌悬液 1μL加入含有改良 MRS液体培养基100μL/孔的标准 96孔板 ,比例为 1∶100,空白对照为未接菌的MRS培养基。培养结束后用酶标仪测定波长 630 nm处的光密度值OD1,倒掉培养基,用蒸馏水水洗 3次去除浮游菌,微孔板在室温下干燥 2h,加入1%结晶紫 100μL/孔,放置 20 min后,蒸馏水水洗6～7次去除孔壁染液直至水洗液为无色,孔板在室温下干燥 30 min,加入 95%乙醇 100μL/孔,微量振荡器上振荡 30 min后,用酶标仪测定OD630nm,OD2,平行实验 3次。黏附率为B,可计算为:

OD1c,OD2c为空白对照吸光度值,B＜0.1为不黏附,B≥0.1为黏附成膜,0.1＜B＜1为中等强度黏附成膜,B＞1为强黏附成膜。

1.2.5 培养条件对LAB生物膜生长的影响

在已加入 100μL MRS培养基的 96孔板中接种LAB1μL,将培养板分别置于 25,30,37,42℃培养 24,48,72 h,平行实验 3次;以 100μL未接菌悬液的孔作为空白对照进行微孔板法光密度测量;将培养基pH分别调至 4.0,6.8,8.0,重复 1.2.4操作。

1.2.6 不同浓度葡萄糖对LAB生物膜生长的影响

在 96孔板板中分别加入含不同浓度的葡萄糖(分别设为 2,4,8,16,32,64,128 mg/mL)的 MRS培养基 100μL,分别接种,在 25,30,37,42℃培养 48 h,测定B值。

1.2.7 不同浓度 NaCl对 LAB生物膜生长的影响

在 96孔板板中分别加入含不同浓度的 NaCl(分别设为 1.5,3,6,12,24,48,96 mg/mL)的 MRS培养基 100μL,分别接种,在 25,30,37,42℃培养 48 h,测定B值。

2 结果与分析

2.1 发酵食品中 LAB菌株筛选结果

分离得到 8株菌,经革兰氏染色镜检、接触酶反应和乳酸定性实验,初步确定 8株乳酸菌。肉类分离菌编号为 L1,L2,蔬菜类分离菌编号为 L3,L4,L5,L6,L7,L8。

2.2 温度、时间和 pH对 LAB生物被膜形成的影响

37℃时,MRS培养基中乳酸菌在不同培养时间的成膜情况如图1所示。表明 37℃下 24 h和 48 h培养,B增加趋势平缓,培养 72 h后,B显著增加。且62.5%(5/8)菌株B＞1,呈强粘附成膜。在其他各个温度下,表现的不同培养时间的成膜趋势与 37℃条件下相一致。

图1 培养时间对LAB生物膜生长的影响

在不同培养温度下,乳酸菌培养 72 h后的生物被膜形成能力如图2所示。结果表明,25℃和 30℃下,所有的 LAB弱成膜作用或不成膜,L2,L3,L4,L7菌株,在 42℃成膜能力较强,L1,L8菌株在 37℃成膜能力最强。一般来讲,随着温度的升高,培养时间延长,B值呈增加趋势,37℃和 42℃有利于促进 8株LAB形成大量生物膜。

图2 培养温度对LAB生物膜生长的影响

乳酸菌在不同 pH值情况下的生物被膜形成结果表明,当 pH 4.0时,在各个试验温度下,8株 LAB均能成膜,且以 37℃显著强黏附,30℃下中等强度成膜黏附,25℃各菌株成膜较弱,抑制或完全不成膜。pH 6.8时,42℃成膜较好,pH 8.0时,乳酸菌不生长或不成膜。可见 pH值偏酸性时,有利于LAB生长成膜。

2.3 添加不同浓度葡萄糖对 LAB成膜率的影响

在MRS培养基中添加不同浓度的葡萄糖,在不同温度条件下,培养 48 h,乳酸菌生物被膜的形成情况如图3所示。结果表明,42℃,低浓度下,随着葡萄糖浓度的升高,各个菌株的成膜能力增强,成膜率增加。当葡萄糖浓度大于 8 mg/mL时各个菌株成膜能力降低,成膜率有所下降,浓度为 128 mg/mL时成膜率为 0,抑制 LAB形成生物膜;25℃下,随着糖浓度的增高,成膜率升高,浓度为 128 mg/mL时成膜率达62.5%(5/8);30℃,葡萄糖浓度为 4 mg/mL时,成膜率最高,当葡萄糖浓度高于 4 mg/mL成膜率下降;37℃下不添加糖成分成膜率最高,随着糖浓度的增加,成膜率都较低。可见在不同温度,添加不同浓度葡萄糖下,实验菌株生物成膜情况不同,两者对其生物膜形成是相互作用的。此外,额外加入葡萄糖,构建新的营养环境,单纯的富于营养并不一定能促进生物被膜的形成,而且在生物被膜的培养过程中,还需要考虑浮游菌和生物被膜菌之间的营养竞争和代谢废物累积效应。[7]

2.4 不同浓度 NaCl对 LAB成膜率的影响

图3 不同浓度葡萄糖对 LAB成膜率的影响

培养基中添加不同浓度的 NaCl,乳酸菌在不同温度下培养 48 h,其生物被膜形成情况如图4所示。不同的温度,得到统一的成膜趋势。即在低浓度NaCl条件下,随着盐浓度升高,菌株成膜能力增加,成膜率上升。当 NaCl浓度大于 24 mg/mL时,随着浓度增加,抑制菌株成膜。

图4 不同浓度 NaCl对 LAB成膜率的影响

3 结论

研究发现,不同培养条件 (温度、时间、pH值)、不同营养条件 (葡萄糖、盐浓度)能影响 LAB生物膜的形成。37℃和 42℃的培养温度,有利于 LAB生物膜的大量形成,低温不利于生物膜的形成。LAB本身产乳酸,在 pH偏酸性下,均能生长,且在 37℃和42℃下成膜效果显著。pH值 8为偏碱性,LAB抑制成膜或完全不成膜。添加糖成分,有利于促进 LAB生物膜形成,高温,高浓度糖成分,抑制 LAB生物成膜。低浓度的 NaCl可促进 LAB形成生物膜,但高于浓度 2.4%时,就抑制 LAB成膜。不同 LAB菌株对不同葡萄糖浓度成膜效果不同,且与温度交互作用。可能在培养过程中,浮游菌和生物被膜菌之间的营养竞争和代谢废物的累积。因此,在食品加工工业中为了有效预防自然环境中乳酸菌造成食品的腐败变质,应尽可能做好食品原材料的清洗或防腐处理,可添加高浓度的 NaCl和保持低温来进行食品保藏。而且对于加工设备和包装材料也应进行清洗杀菌处理,减少糖分残余,避免LAB生物膜形成。

[1] Naitou S.Nyusankin ni yoru shyokuhin no henpai to ozonni yoru boushi gijyutsu[J].Antibact Antifung,1999,27:171-181.

[2] Hiromi Kubota,Shouko Senda,Nobuhiko Nomura.Biofilm formation byLactic acid bacteria and resistance to environmental stress[J].The Society for Biotechnology,2008,106(4):381-386.

[3] 李燕杰,杜冰,董吉林,等,食品中细菌生物被膜及其形成机制的研究进展 [J].现代食品科技,2009,25(4):435-437.

[4] 凌代文,东秀珠.乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999:208-210.

[5] 张宏梅,李发俊,刘学禄,等.部分腌渍食品中乳酸菌的分离与耐药性分析[J].食品与发酵工业,2010,36(4):25-27.

[6] 汪 红,曹 瑜,罗时宁,等.四川泡菜乳酸菌的分离鉴定及其特性研究[J].四川大学学报:自然科学版,2008,45(6):1 509-1 512.

[7] 段韵涵,韩北忠,杨葆华,等.培养条件对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响[J].中国酿造,2008(3):17-20.